免疫吸附剂及其制备方法

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

1.本发明涉及免疫吸附剂，具体地涉及用于特发性膜性肾病治疗的免疫吸附剂及其制备方法。

背景技术：

2.从液体中分离除去特定物质的分离纯化方法具有广泛应用。一般而言，当从成分简单的液体分离特定物质时相当操作简单、方便，但当液体成分复杂时，例如当液体为血液时，从中特异性分离去除特定物质或成分，而不影响液体其他成分则往往存在困难。
3.目前已经开发了若干血液吸附剂，例如wo2019174560a1公开了一种可用于生物流体净化，例如血液透析、腹膜透析的组合物，其包括渗透剂和毒素去除试剂，其中毒素去除试剂能够在渗透交换的条件下去除生物流体中的毒素。还提供了含有组合物的透析溶液和试剂盒，以及使用前述组合物去除生物流体中的毒素的方法、以及治疗与毒素相关的疾病的方法。再例如，cn109985230a公开了一种蛋白在制备预防和治疗肾病药物中的应用，其是sdss1蛋白用于制备预防和治疗肾病的药物。该发明的sdss1能够有效的结合晚期氧化蛋白产物并降低由它们引起的细胞毒性，缓解慢性肾病模型动物的疾病症状。
4.然而现有技术中的免疫吸附剂没有特异性。目前仍亟需特异性强的免疫吸附剂，以其特异性吸附作用除去液体中的特定成分。

技术实现要素：

5.为解决现有技术中的技术问题，本发明人发现通过异源表达来源于人体的特定核酸仍能得到特异性结合人体血液中有害成分的蛋白。本发明适于大规模表达制备，从而大大降低了生产成本，有效降低血液等的净化成本。此外，通过将蛋白偶联得到的吸附剂具有优异的特异性。具体地，本发明包括以下内容。
6.本发明的第一方面，提供一种特异性免疫吸附剂，所述特异性免疫吸附剂包括亲和配基和与之偶联的载体，其中，所述亲和配基由选自seq id no:1所示的核苷酸序列编码得到。
7.根据本发明所述的特异性免疫吸附剂，优选地，通过氨基偶联法使所述亲和配基和所述载体偶联。
8.根据本发明所述的特异性免疫吸附剂，优选地，其通过使seq id no:1所示的核苷酸序列在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中表达得到。
9.本发明的第二方面，提供根据第一方面所述的特异性免疫吸附剂的制备方法，其包括凝胶的环氧活化、偶联6-氨基己酸、封闭环氧基、保护剂和活化剂反应和配基偶联。
10.根据本发明所述的制备方法，优选地，所述凝胶的环氧活化包括：取cl-6b凝胶，依次加入naoh、dmso、环氧氯丙烷，放置于摇床反应后进行丙酮水溶液梯度清洗和水洗。
11.根据本发明所述的制备方法，优选地，所述偶联6-氨基己酸包括：取活化凝胶加入缓冲液，再加入6-氨基己酸，反应直至偶联完成。
12.根据本发明所述的制备方法，优选地，所述封闭环氧基包括：偶联后的凝胶经洗涤后加入封闭剂进行环氧基封闭。
13.根据本发明所述的制备方法，优选地，所述保护剂和活化剂反应包括：封闭后的凝胶经洗涤后加入n,n-二甲基甲酰胺，混匀后加入保护剂和活化剂，避光反应。
14.根据本发明所述的制备方法，优选地，所述偶联配基包括：用水快速洗胶，凝胶和等体积的所述配基反应后去上清，加入封闭剂封闭。
15.本发明的第三方面，提供一种用于吸附抗体的体外方法，其包括使根据权利要求1-3任一项所述的特异性免疫吸附剂与包含抗体的液体接触的步骤。
16.本发明的有益效果在于：
17.(1)本发明所采用的蛋白基因序列从全长pla2r序列中优化而来，其分子量仅为全长pla2r蛋白的约26％，表达量更高且更易保持生物活性，一次吸附即可降低约76.66％的血浆中的自身抗体浓度。
18.(2)本发明表达蛋白的宿主为昆虫细胞，所采用的表达系统为昆虫细胞-杆状病毒表达系统，该表达系统不仅具备表达量较高、成本低的特点，同时还兼备真核表达系统复杂的翻译后修饰、能使蛋白正确折叠的能力。
19.(3)本发明采用蛋白作为亲和配基制备吸附剂，与传统血液净化吸附剂相比，能特异性地吸附致病的pla2rab，因此在血液净化治疗后患者血液中其它抗体或蛋白的含量基本不会减少，仅降低pla2rab的滴度。
附图说明
20.图1昆虫细胞表达的pla2r-td的纯化结果。
21.图2免疫组织荧光法原理示意图。
22.图3免疫组织荧光结果。
23.图4免疫吸附剂的吸附特异性测定结果。
具体实施方式
24.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
25.本技术的说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便本技术的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施，且“第一”、“第二”等所区分的对象通常为一类，并不限定对象的个数，例如第一对象可以是一个，也可以是多个。此外，说明书以及权利要求中“和/或”表示所连接对象的至少其中之一，字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
26.特异性免疫吸附剂
27.本发明的特异性免疫吸附剂，其用于从液体中通过特异性免疫吸附从而分离所需物质，例如抗体，特别是抗pla2r抗体。本发明的特异性免疫吸附剂包括亲和配基和与之偶联的载体。
28.本发明中，亲和配基为源自磷脂酶a2受体胞外结构域的蛋白，其为具有抗原表位的重组蛋白。磷脂酶a2受体的来源不特别限定，可根据需要而选择，其实例包括但不限于人类、哺乳动物如猩猩、鼠、狗、猫、猪等。在示例性实施方案中，免疫吸附剂用于清除人血液特定免疫球蛋白，此时磷脂酶a2受体的来源为人类。
29.需要说明的是，本发明的蛋白源自全长pla2r，但其分子量远小于全长pla2r蛋白的分子量，但依旧保持或具有增强的抗原性，从而结合抗pla2r抗体，或吸附抗pla2r抗体，或降低抗pla2r抗体的滴度，或降低抗pla2r抗体浓度或含量。在具体实施方案中，本发明的免疫吸附剂可特异性吸附不低于70％的抗pla2r抗体，从而显著减低且仅降低抗pla2r抗体的量。
30.本发明的蛋白可通过已知方法制备得到。例如人工合成方法和生物表达法。这些方法可采用本领域已知的任何方法。人工合成方法的实例包括但不限于固相合成法、液相合成法等。示例性步骤包括去保护、激活和交联以及洗脱和脱保护等。
31.生物表达法包括使蛋白的编码核酸在宿主细胞或非细胞体系内表达产生蛋白的过程。优选地，表达系统为昆虫细胞-杆状病毒表达系统。本发明所选择的昆虫杆状病毒表达系统相比其他表达系统，具有安全性好，表达水平高，可进行翻译后加工及表达产物的异源性小的优点，是适用于本发明编码核酸表达的理想的真核表达系统。
32.进一步优选地，本发明的亲和配基通过使seq id no:1所示或与其同一性为80％以上、优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选97％以上，如99％以上，更优选来源于同一物种的核苷酸序列在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中表达得到。还优选地，对上述碱基序列是进行宿主密码子偏好性改造后得到的序列。例如，可根据昆虫细胞进行宿主密码子偏好性改造。本发明中，经宿主密码子偏好性改造是指为了适应于不同宿主表达的需要，根据简并密码子来对碱基序列进行碱基替换，密码子偏好性改造一般不改变产物蛋白或多肽的序列。
33.本发明的蛋白的生物生产方法可根据本领域内的一般操作进行。其包括但不限于下述步骤：构建表达载体，转染或转化，收获病毒或iptg诱导表达，纯化得到所述蛋白。这些操作是本领域技术人员已知的，并且可通过例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物容易地获知具体操作流程。
34.本发明中，与亲和配基偶联的载体不特别限定，载体的实例包括但不限于：活性炭、聚苯乙烯材料、金属、琼脂糖、凝胶、树脂、离子化偶联载体或它们经亲水性改造制备得到的任何载体。离子化偶联载体的非限制性实例包括bsa载体、klh载体、ova载体、polyk载体等。本发明人通过研究发现，一方面，全长pla2r基因表达的蛋白产量不高，达不到理想的吸附效果。另一方面，全长pla2r蛋白在进行免疫吸附时效果较差，推测其与载体的复杂构象可能导致有效表位的包埋有关。因此，本发明选取全长pla2r蛋白的特定序列用于作为吸附剂的亲和配基，从而充分暴露表位，实现一次吸附就降低自身抗体浓度的目的。
35.免疫吸附剂的制备方法
36.本发明的免疫吸附剂的制备方法包括将亲和配基和载体偶联的步骤和可选地，合成或表达蛋白的步骤。如上所述，已说明了蛋白的合成或表达，下面详细说明亲和配基和载体的偶联。
37.本发明中亲和配基和载体的偶联可采用本领域已知方法进行，只要能够使亲和配
基和载体之间形成共价键连接即可，偶联方法的实例包括但不限于偶联在所述配基的n端的氨基酸上，或偶联在所述配基的c端氨基酸上，或偶联在所述配基序列中的半胱氨酸上。
38.在示例性实施方案中，本发明采用氨基偶联法使亲和配基和载体偶联。其示例性步骤包括：cl-6b的环氧活化、偶联6-氨基己酸、封闭环氧基、nhs化、偶联配基。
39.本发明中，cl-6b的环氧活化包括取cl-6b凝胶，依次加入naoh、dmso、环氧氯丙烷，放置于摇床中反应，随后进行丙酮水溶液梯度清洗和水洗。其中，naoh的浓度不特别限定，可以是例如0.1-5m，优选0.2-3m等。cl-6b凝胶的浓度优选为0.01-1g/ml，还优选为0.05-0.5g/ml。优选地，naoh、dmso、环氧氯丙烷的加入的体积比为1-5：5-10:1。摇床中的反应时间一般为1-10小时，优选2-5小时。
40.本发明中，偶联6-氨基己酸包括取活化的cl-6b胶加入缓冲液，再加入6-氨基己酸，反应直至偶联6-氨基己酸。其中缓冲液的实例包括但不限于碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。偶联反应时间不特别限定，一般在8-24小时范围内，优选10-20小时，更优选15-18小时。cl-6b凝胶与缓冲液的体积比优选为1:1。6-氨基己酸的终浓度为0.1-0.8m，优选为0.2-0.6m。加入6-氨基己酸后，进一步包括调节ph的步骤，ph为碱性，优选为不低于10.90，还优选为调节至ph为11。偶联优选在25-40℃的摇床中进行，孵育温度进一步优选为28-32℃，且转速不低于150rpm。
41.本发明中，封闭环氧基包括ech胶依次经过水洗、nacl溶液洗涤、水洗，加入封闭剂封闭环氧基。优选地，封闭剂为乙醇胺-水溶液。其中，nacl溶液的浓度一般为0.5-5m，优选1-3m，如1m等。乙醇胺-水溶液中两者的体积比不特别限定，可以根据需要而自由配制，例如1:10-10:1，示例性比例为1:1。封闭环氧基优选在25-40℃的摇床中进行，孵育温度进一步优选为28-32℃，且转速不低于150rpm。
42.本发明中，保护剂和活化剂反应包括封闭后的胶依次经过水洗、tris-乙酸-nacl洗涤、水洗，加入n,n-二甲基甲酰胺，混匀后加入保护剂和活化剂避光反应。优选地，保护剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，活化剂优选为n-羟基琥珀酰亚胺。其中，n,n-二甲基甲酰胺的加入量不特别限定，优选地等体积加入。避光反应的时间不特别限定，可以例如10-30小时，优选15-20小时。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的具体比例不特别限定，可以根据需要而自由配制，例如1:1。优选地，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的终浓度均为0.01-0.3m，优选为0.08-0.2m。活化反应优选在25-40℃的摇床中进行，孵育温度进一步优选为28-32℃，且转速不低于150rpm。
43.本发明中，偶联配基包括用水快速洗胶，凝胶和等体积的吸附介质(即，本发明的配基)反应后去上清，加入乙醇胺-水溶液封闭。其中，乙醇胺-水溶液的ph一般为6-8.5，优选一般为7.5-8，其中乙醇胺的浓度一般为4-15％，例如6-10％等。封闭时间不特别限定，但优选不低于4小时。配基偶联优选在低温、低转速的摇床中进行，孵育温度进一步优选为0-5℃，且转速不高于70rpm。
44.在本发明的制备方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。制备反应中所用的、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以作适当改变的。
45.用于吸附抗体的体外方法
46.本发明的免疫吸附剂可用于吸附抗体，特别是混合物，如液体中的抗体。在示例性实施方案中，本发明的液体为特发性膜性肾病患者的血液。通过本发明的免疫吸附剂可以有效清除抗体，特别是抗pla2r抗体，从而用于特发性膜性肾病血液的净化治疗。
47.本发明的体外方法包括使本发明的免疫吸附剂或蛋白与液体接触的步骤。其包括：(1)特发性膜性肾病受者的血液提取；(2)获得所述血液中的血浆组分；(3)将所述血浆组分与免疫吸附剂混合，低温孵育。其中在步骤(3)中，低温是指低于室温的温度，优选为0-5℃；孵育时间不特别限定，只要能够实现本发明的吸附效果即可。孵育时间一般为2分钟以上，例如5分钟、10分钟、15分钟。本发明的特异性吸附剂能够大大缩短其与抗pla2r抗体的吸附时间，吸附效率显著提高。本发明的体外方法进一步包括：anti-pla2rab浓度的测定，测定方法不特别限定，可以采用本领域已知抗体检测的方法进行。
48.本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，在上述步骤前后，或步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。
49.实施例1
50.一、重组转移载体pfastbac1的构建
51.取200ul实验室保藏的pfastbac1甘油菌，接种到20ml新鲜的lb培养基(含100μg/ml的ampicillin)中扩大培养，使用质粒小提试剂盒(omega)提取pfastbac1空质粒，-20℃保存。
52.构建pla2r三结构域重组蛋白(以下简称pla2r-td)基因序列连接于通用载体puc57上，设计pcr引物一并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用pcr引物对pla2r-td目的片段基因序列进行扩增。
53.r：ccgctcgagctcaacgatttcgtggtcgatgt；
54.f：cgcggatccatggcagaaggagtggccgc。
55.使用quickcut
tm
bamh i与xho i(takara bio)两种快切酶对pfastbac1空载体和扩增的pla2r-td目的序列进行双酶切，产生黏性末端。使用t4 dna ligase(takara bio)连接pfastbac1空载体和扩增的pla2r-td目的序列，得到重组转移载体pfastbac1-pla2r-td。
56.二、重组穿梭载体bacmid-pla2r-td的获得
57.构建完成pfastbac1-pla2r-td转移载体，经测序无误后转化至dh10bac感受态细胞(北京华越洋)中，通过两轮蓝白斑筛选剔除假阳性转化子，挑取阳性单菌落接种到20ml新鲜的lb培养基(含50μg/ml kanamycin,7μg/ml gentamicin和10μg/ml tetracycline)中扩大培养使用质粒提取试剂盒(qiagen)提取转座成功的重组穿梭载体bacmid-pla2r-td，用于转染sf9昆虫细胞。
58.三、高滴度病毒的制备
59.准备35mm细胞培养皿中的贴壁sf9细胞，细胞总数在7-9
×
105个之间。吸去含抗生素的培养基，加入含2μg重组bacmid-pla2r-td、7μg聚乙烯亚胺的无抗性培养基，转染5～6小时后将培液换成含双抗的培养基，27℃静置培养96小时。离心取上清即为p1代杆状病毒，将p1代病毒加至适宜密度的悬浮培养的sf9细胞中可继续扩增，重复感染两代后可得到高滴度的p3代杆状病毒。
60.实施例2
61.本实施例为蛋白pla2r-td的制备。
62.一、pla2r-td的表达
63.获得高滴度的p3代杆状病毒后，通过westernblotting确定最佳病毒接种量、细胞密度与表达时间等表达条件，随后感染悬浮培养的sf9昆虫细胞(接种量为每1
×
108个细胞添加1mlp3代杆状病毒)。将摇瓶置于27℃、150rpm条件下培养72-96小时后，500
×
g离心收集细胞。
64.二、pla2r-td的纯化
65.使用5-10倍体积的pbs重悬sf9细胞，随后使用高压匀浆机在500mpa的条件下破碎细胞。破碎液首先通过gst亲和层析柱进行初步纯化，再通过凝胶筛分的方法二次纯化，即可得到蛋白pla2r-td，纯化结果如图1所示，pla2r-td大小约为74.5kda，与预期相符。
66.实施例3
67.本实施例为pla2r-td生物活性的表征。
68.一、免疫组织荧光法检测结合
69.本实施例目的在于评价pla2r-td与anti-pla2r ab的结合能力及结合特异性，原理见图2。取三位分别为imn轻症、重症和微小病变(非imn)患者的肾穿刺组织切片，组织切片上存在抗原抗体复合物，将切片与带gst标签的pla2r-td孵育，随后孵育抗gst标签的一抗和偶联绿色荧光的二抗，即可在激光共聚焦显微镜下观察荧光区域。图3显示，存在抗原抗体复合物的肾小球区域有荧光信号，且荧光强度较高，而周围组织无信号。上述结果证明pla2r-td能与切片样本上免疫复合物中的自身抗体结合。此外微小病变患者的切片无明显的荧光信号(未放出)，证明pla2r-td能与自身抗体结合且具备有特异性。
70.二、elisa检测结合
71.取分别是imn轻症(anti-pla2r ab检测值：43.35ru/ml)、重症(anti-pla2r ab检测值：544.5ru/ml)和微小病变患者(anti-pla2r ab检测值：＜14ru/ml)的血浆行elisa实验，检测pla2r-td能否和血浆中的抗体结合，elisa结果与专业医学检测机构的结果一致，重症病人的吸光度值较轻症更高，作为阴性对照的微小病变患者则基本没有颜色变化，证明蛋白能与血浆中的自身抗体结合且具备特异性。
72.实施例4
73.一、cl-6b的环氧活化
74.取16gcl-6b凝胶，加入20ml 2m naoh、60ml dmso、10ml环氧氯丙烷，先将胶与naoh溶液混匀，再加入dmso，最后加入环氧氯丙烷。放置于250ml三角瓶中，使naoh终浓度为0.4m。在40℃、175rpm的条件下放置于摇床中反应2小时。洗胶：凝胶经过30％、70％、100％丙酮依次洗后再重新经70％、30％丙酮，最终置换为水。
75.二、偶联6-氨基己酸
76.取活化的cl-6b凝胶加入等体积的0.1m碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液(0.1m碳酸氢钠加入naoh调节ph＝11.00)，加入终浓度为0.2m的6-氨基己酸，用1m naoh溶液小心调节ph＝11.00。在30℃、175rpm条件下放置于摇床中反应至少17小时。
77.三、封闭环氧基
78.偶联完成的凝胶经过水、1m nacl、水依次清洗后，加入等体积6％乙醇胺-水(浓盐酸调节ph＝8.00)，在30℃、175rpm条件下放置于摇床中反应至少20小时。
79.四、nhs化
80.凝胶胶封闭后经过水、tris-乙酸-nacl(或1m nacl)、水洗依次清洗，加入等体积dmf，混匀后加入终浓度为0.1m edc和0.1m nhs。在30℃、175rpm条件下放置于摇床中避光反应至少20小时。最后用大量dmf洗，室温条件下保存于dmf中。
81.五、偶联配基
82.用大量水快速洗胶，取实施例2中制备得到的蛋白pla2r-td与胶混合，在4℃、60rpm的条件下反应0.5-2小时，离心去上清，加入6％乙醇胺-水(ph＝8.00)，封闭至少4小时。偶联完成的免疫吸附剂经过pbs洗涤后，加入少量叠氮钠，保存于4℃。
83.实施例5
84.本实施例为免疫吸附剂对患者血浆中anti-pla2rab的吸附测定。
85.取1.5ml imn患者混合血浆，分为三等份，每等份0.5ml，其中第一组不作吸附处理，仅使用pbs稀释1倍至1.0ml；第二组为阴性对照组，将imn血浆与0.1ml未偶联pla2r-td的空白凝胶混合，在4℃下共同摇动孵育0.5小时后吸取上清，再分2次加入共5个胶体积(0.5ml)的pbs洗涤凝胶，洗下未与凝胶结合的组分，最后将上清与洗涤液混合；c组为实验组，即免疫吸附组，将imn血浆与0.1ml偶联成功的免疫吸附剂混合，在4℃下共同摇动孵育0.5小时后吸取上清，再分2次加入共5个胶体积(0.5ml)的pbs洗涤凝胶，洗下未与凝胶结合的组分，最后将上清与洗涤液混合。委托由赛瑞鑫特医学检验所检测样品a、b、c中的anti-pla2r ab浓度，结果如表1所示(imn阴性参考区间：＜14ru/ml)。结果如表1所示：本发明制备的免疫吸附剂对患者血浆中的anti-pla2r ab有良好的吸附效果，原血浆抗体浓度为28.54ru/ml，而免疫吸附后为6.66ru/ml，进行一次血液净化可降低约76.66％的anti-pla2r ab浓度(＜14ru/ml)。
86.表1.免疫吸附剂对患者血浆中anti-pla2r ab的吸附结果
[0087][0088]
实施例6
[0089]
本实施例为免疫吸附剂吸附特异性测定。
[0090]
取1.5ml imn患者混合血浆，分为三等份，每等份0.5ml。其中第一组不作吸附处理；第二组为阴性对照组，将imn血浆与0.1ml未偶联pla2r-td的空白凝胶混合，在4℃下共同摇动孵育0.5小时后吸取上清；c组为实验组，即免疫吸附组，将imn血浆与0.1ml偶联成功的免疫吸附剂混合，在4℃下共同摇动孵育0.5小时后吸取上清。分别测量上述三份血浆中各组分的浓度，结果如图4所示，仅anti-pla2r ab的浓度有大幅度降低，血浆中免疫球蛋白或其它蛋白的含量在误差范围内无明显降低，例如，igg、iga、白蛋白、β2-mg、il-6、tnf-α变化幅度均小于4％或无变化，证明该免疫吸附剂特异性地吸附了anti-pla2r ab。因此在血液净化治疗后患者血液中其它抗体或蛋白的含量基本不会减少，仅降低anti-pla2r ab的滴度。
[0091]
上面结合附图对本技术的实施例进行了描述，但是本技术并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本技术的启示下，在不脱离本技术宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多
形式，均属于本技术的保护之内。