色谱柱固定相参数与选择

作者：张馨予

本文通过介绍网络数据库，给读者提供一种色谱柱选择的新思路。对于色谱柱固定相各参数，本文给出了详细解释说明，提供了具体应用策略，给广大读者提供了借鉴意义。

药品质量研究阶段，有关物质方法开发是一项极具挑战性的工作。但由于色谱柱选择不当，导致方法开发过程低效费时。如何高效的找到自己所需的色谱柱？2017年，笔者有幸聆听了肖柏明老师的讲座，随后便开始关注色谱柱的选择。本文笔者结合自己的应用，简单介绍一下如何利用固定相参数选择色谱柱。当然，条条大道通罗马，有些情况我们改其他参数也能获得成功。但本文仅讨论如何根据固定相参数选择色谱柱，获得我们想要的结果。

在讨论固定相参数之前，笔者先简单的介绍几个日常工作中常用的色谱网站。

https://www.acdlabs.com

HPLC Column网站笔者使用频率较高，可以根据不同参数，选择不同的色谱柱。此网站与U.S.Pharmacopeial Convention网站中PQRI Database数据库基本一致，测试方法是Snyder/Dolan法。目前，两组数据库内均有700多款色谱柱，市面常见色谱柱都能查到。ACD/Labs网站色谱柱参数测试方法应该是Euerby法，而U.S. Pharmacopeial Convention中USP Database数据库是采用的美国药典方法。这两个数据库的色谱柱少一些，但鉴于测试模型不同，在筛选色谱柱时可以相互参考。

本文的介绍仅以HPLC Column数据库为例，讨论如何应用这些参数来筛选色谱柱。表1是HPLC Column数据库参数列表的部分节选，笔者仅讨论Fs、H、S*、A、B、C (pH 2.8)、C (pH 7.0)及EB retention factor等参数，其他基本信息就不再讨论。

表1 HPLC Column数据库参数列表（节选）

色谱柱固定相参数与选择

Fs-此参数用来衡量两款色谱柱的相似度。Snyder/Dolan法中，如果Fs≤3，可认为两款色谱柱相互替代。利用这个参数，可以帮助我们查找相似的色谱柱。比如药典方法规定的色谱柱，如果暂时没有，可利用此参数查找替代品。如果方法开发中，某色谱柱无法满足分离要求，此时需要查找与所用色谱柱Fs值差异较大的色谱柱，这样才能提供不同的分离效果。

H/EBretention factorH-疏水性作用力，EB retention factor-乙苯保留因子。H值是所有键合相疏水作用力的综合，包括一些封端基团的疏水性。EB retention factor用于衡量中性物质保留强弱。EB retentionfactor一般与H项对应，H数值大，EB retention factor一般也大，如表1中的Zorbax Bonus RP与EC Nucleosil 100-5 Protect 1色谱柱。但也有不一致的情况，如表1中的Zorbax Bonus RP与HypersilPrism C18 RP色谱柱。造成这种现象的原因可能来自两方面：一方面是由于封端基团所致。这些基团虽然提供了H值，鉴于其接近硅胶球，未与乙苯接触，故未提供保留作用。第二个方面可能是由于乙苯的结构所致。对于键合相较密的固定相，乙苯难以进入，故对其保留有影响。

根据笔者的工作经验，采用EB retention factor这个数值判断保留的强弱要比H值相对准确一些。有关物质方法开发中，时常遇到有关物质保留太强，需要高浓度有机相洗脱。此时可根据EB retention factor选择数值低一些的色谱柱，减弱其保留。如表1所示，Hypersil Prism C18 RP色谱柱的EB retention factor为4.8，EC Nucleosil 100-5 Protect 1色谱柱的EB retention factor为2.7，两者相差约两倍。同比例有机相情况下，EC Nucleosil 100-5 Protect 1对中性物质的保留要弱一些。虽然两款柱子EB retention factor相差约两倍，但这并不表示有机相比例可降低2倍。根据洗脱的3倍原则，有机相比例改变10%，保留因子改变约3倍。而Hypersil Prism C18 RP与EC Nucleosil 100-5 Protect 1两款色谱柱保留因子仅改变约2倍，因此即便更换这两款色谱柱，其有机相比例变化也不会超过10%。这一点，在应用此参数时需要注意。

S*-空间位阻，较大的S值意味固定相键合的比较紧密，这会导致体积较大的溶质分子不容易进入键合相，保留较弱。笔者在实际工作中主要运用此参数进行非对映异构体的分离。比如苯环上不同位置的基团影响溶质分子体积的大小，这时候就可以利用S值选择色谱柱对此类异构体分离。笔者曾遇到苯环上位置异构的两个杂质，在多数色谱柱上均基本重合，无法有效分离。笔者利用S值选择的色谱柱，却基本实现了基线分离。至于S值较大对异构体分离有利还是较小有利，目前笔者几个试验结果证明S值较大对异构体分离有利。但此参数的规律性并不强，后期还需继续研究总结。