伴随诊断行业研究：核心技术突破不断，伴随诊

作者：张馨予

　　1 靶向引领个性化医疗，基因测序方法为核心

　　1.1 伴随诊断样本类型

　　伴随诊断需要通过对样本进行基因测序等分析手段进行药物受体作用位点的确定，目前常用样本类型为组织以及体液。对组织进行分子分析的技术称为组织活检，具体是指应诊断、治疗的需要，从患者体内切取、钳取或穿刺取出病变组织，对其进行分子分析。

　　对肿瘤伴随诊断来说，肿瘤组织活检是获取肿瘤 DNA 的金标准。对液体进行分析的技术称为液体活检，具体是指通过对患者的体液中的分析物（CTC、cfDNA、ctDNA 等）进行分子分析，以指导患者的个性化治疗及预后，目前市面上的伴随诊断试剂盒大部分属于这一类型。

　　从临床应用上看，组织活检与液体活检各有优劣。虽然目前基于液体活检的肿瘤伴随诊断近年来处于蓬勃发展之中，但并非意味着其已经能取代组织活检技术，两者合作互补或许能大大提高诊断效率，减少过度治疗。随着液体活检技术不断发展，未来基于液体活检的肿瘤伴随诊断或将进一步替代组织活检技术，成为伴随诊断检测的主力军。

　　1.2 伴随诊断主要基因测序方法

　　伴随诊断是通过基因测序等手段进行药物受体作用位点的确定，随着靶向药的应用推广，伴随诊断逐步确立起指导治疗的重要地位。在伴随诊断所用检测技术中，PCR、NGS、FISH 是目前市场上应用最广泛的技术，其各有优劣，在各大伴随诊断企业中均有分布。

　　1.2.1 PCR

　　PCR（聚合酶链式反应）是一种用于放大扩增特定 DNA 片段的分子生物学技术，可以看作是生物体外的特殊 DNA 复制，其最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加。在存在 DNA 模板、引物、dNTPs、适当缓冲液 (Mg2+) 的反应混合物中，在热稳定 DNA 聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的核酸片段进行扩增，这种扩增是以模板 DNA 与引物之间的变性、退火、延伸三步反应为一个周期，循环进行，使目标 DNA 片段得以扩增。

　　最初的普通 PCR 技术只能通过对靶基因进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析，实现简单的定性分析，这是第一代 PCR。鉴于（1）第一代 PCR 采用的核酸燃料对实验人员及环境造成较大伤害、（2）PCR 完成之后开盖检测易污染造成假阳性结果、（3）检测耗时长且操作麻烦易出错及（4）只能做定性检测，二代 PCR 得以发展并成为目前国内 PCR 技术主流。

　　第二代 PCR 就是荧光定量 PCR 技术（Real-Time PCR），也叫做 qPCR，是指通过应用荧光染料或荧光标记的特异性探针(如 Taqman Probe)，在 PCR 反应体系中加入荧光基团对聚合酶链反应产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，结合软件对荧光信号进行分析，实现基因检测的定性和定量分析。qPCR 常用于传染病病原体检测，疾病耐药基因研究，药物疗效考核，遗传疾病诊断。

　　随着反应循环次数的增加，被扩增目的基因片段呈指数增长，通过实时检测对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得 Ct 值，利用已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因数。由于 rPCR 定量过程通过 Ct 值间接反映，因此称为第二代 PCR。

　　应用荧光染料：SYBR green：在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。

　　应用特异标记探针：Taqman Probe：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。

　　随着 PCR 系统的进一步发展已经对检测，一种具备较高灵敏度和特异性的数字PCR 技术开始被广泛应用于肿瘤临床检测和科学研究中。数字 PCR（Digitai PCR， dPCR）是一种新兴的核酸检测技术，通过将每个核酸分子分配到一个独立的空间内，避免选择性扩增对扩增结果的干扰，可实现核酸模板绝对定量、稀有突变检测、拷贝数变异、DNA 甲基化、基因重排等检测功能。由于数字 PCR 可以实现直接定量分析，被称为第三代 PCR。