解决细节问题，快速完成WB所有实验

作者：张馨予

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蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）以蛋白质为研究对象，先借助SDS-PAGE凝胶，将总蛋白按照不同的分子量大小进行分离，然后将胶上的蛋白质转移到膜上，再利用相应的特异性抗体对靶蛋白进行定量或定性检测的方法。

SDS-PAGE电泳（左）转印及检测（右）

一、实验流程

从Stark团队建立了蛋白印记的方法至今，始终如一的实验技术流程，造就了Western blot的经典所在。每一步必不可缺，每一步都需认真对待，才能最终得到一个完美的结果。

图1. Western blot 的实验流程图

（一）样本制备

样本制备时许多方位考虑，包括裂解液的选择，后续实验的应用等：

1、尽可能提取完全或降低样本复杂度，集中提取某个样本部位总蛋白，比如只提膜蛋白；

2、保持蛋白处于溶解状态（有针对性的对裂解液的pH盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）；

3、提取蛋白过程防止降解、沉淀等（最好冰上操作，并加入适量的蛋白酶抑制剂20124ES或磷酸酶抑制剂20109ES）；

4、减少样本的粘稠度，去除核酸等分子（全能核酸酶20156ES或采取超声处理）；

5、细菌、真菌、植物细胞或者组织，还需要借助破壁的酶来进行蛋白提取。

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图2. 细胞结构及裂解液选择推荐

（二）蛋白定量

准确测定蛋白样本浓度，既能标准化电泳时蛋白上样量，又能更好的配合内参靶标对目的蛋白进行定量分析。

表1. 常见的蛋白定量方法比较

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（三）蛋白电泳

图3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理示意图

选择合适的蛋白胶，能够更好的对目的蛋白进行分离及检测。原则：高浓度的蛋白胶适合分离小分子量的蛋白；低浓度的蛋白胶适合分离高分子量蛋白；梯度浓度胶可以兼容多种浓度的分离效果。

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图4. 蛋白胶浓度分离蛋白分子的范围

蛋白胶类型选择，既可节省蛋白电泳时间，又可对电泳效率进行提高。

表2. 不同蛋白胶组分组成及差异

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（四）蛋白转膜

转膜即将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）。蛋白转膜方法可大致分为湿转和半干转两种类型。用于Western blot的膜也有不同的类型及差异：

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转印小技巧：

由于SDS能够阻止蛋白与膜的结合，因此小分子蛋白转膜可不加SDS，同时甲醇浓度提高到20%；大蛋白易在凝胶里形成沉淀，转膜缓冲液中加入0.1%SDS，可增加蛋白的溶解性；由于甲醇易使SDS从蛋白上脱离，可降低甲醇的浓度（低至10%或者更低）来防止蛋白沉淀。

（五）膜封闭

封闭剂种类：脱脂奶粉（36120ES）、BSA（36101ES）、动物血清等，某些品牌特定的封闭剂等。

封闭剂使用注意事项：

1、做免疫组化和免疫荧光实验建议用血清封闭；

2、某些抗体使用BSA封闭可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，具体需阅读说明书；

3、以下情况不用脱脂奶粉：

生物素化标记的抗体；磷酸化抗体检测蛋白磷酸化；碱性磷酸酶（AP）显色方法

4、封闭时间：一般封闭1-2 h即可；后续可根据实验结果的背景强度来延长时间或更改封闭液种类。

（六）抗体孵育

蛋白抗体选择时的原则：

核实靶标基因；

明确实验类型（WB\ELISA\IHC等）；

分析样本来源。

抗体根据标记靶标方式的不同，分为直标和间标法两种，具体差异如下图：

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图6. 直标抗体与间标抗体比较

（七）结果成像

常用的WB显色方法有两种，一种是DAB显色法（36201ES-36203ES）；另一种是ECL显色法（36208ES）。

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图7. WB成像原理及结果

DAB即二胺基联苯胺，是过氧化物酶(如HRP)的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色的变化和积累，形成浅棕色不溶物。