Gateway技术：克隆、表达新方法

作者：张馨予

同时将您的基因转移到多个表达系统

在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达

一、一种更好的克隆方法

Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。

图1 Gateway技术的灵活性

目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。

Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。

此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。

二、一项强大而可靠的技术

Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。

Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。

表1 反应和术语总结

反应反应位点产物产物结构
BP反应 attB×attP 入门克隆 attL1-基因-attL2
LR反应 attL×attR 表达克隆 attB1-基因-attB2

图2 Gateway技术总结

在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。

完成构建Gateway表达克隆仅需两步（图2）：

（1）创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。

（2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。）

有几种方法可以构建Gateway入门克隆。无论您选择何种方法，创建的入门克隆都是准备用来与各种目的载体进行重组。

（1）PCR克隆（定向TOPO克隆至入门载体或与供载体B×P重组）

（2）限制性内切酶消化和连接进入入门载体

（3）使用pCMV•SPORT6或pEXP-AD502*构建Gateway兼容cDNA文库

（4）Gateway改造过的克隆资源*

* 这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。这些克隆可以通过与供载体及BP Gateway酶反应转换到入门载体。获得已有克隆资源的更多信息。

三、PCR定向（PCR-Directional）TOPO克隆

定向TOPO克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。进行5分钟的简单连接，产生>90%的重组子。您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获得克隆，而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。

定向TOPO克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。平端PCR产物定向克隆的效率>90%，从而简化了筛选。同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或者限制性内切酶。

目前有两种定向TOPO克隆载体。pENTR/D-TOPO 和pENTR/SD/ D-TOPO（表2和图3）有以下特点：

位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway目的载体进行有效重组

通用M13位点便于测序

基于pUC的ori位点提供高产量质粒

大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因筛选

表2 两种pENTR/D-TOPO载体的简单比较

入门载体特点优点
pENTR/D-TOPO 无SD （Shine-Dalgarno）位点真核细胞中天然、N-或C-端融合；大肠杆菌中N-端融合；如果基因包含有SD序列，可在大肠杆菌中进行C-端或天然蛋白表达
pENTR/SD/ D-TOPO 含SD （Shine-Dalgarno）位点包含基因10和一个SD序列，可以有效的启动天然蛋白和融合蛋白在大肠杆菌中的表达

图3 Gateway定向TOPO克隆

四、构建入门载体的各种选择

1、限制性内切酶消化