基于三螺旋DNA结合级联信号放大策略检测黄曲霉

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

基于三螺旋DNA结合级联信号放大策略检测黄曲霉毒素B1的方法与流程

基于三螺旋dna结合级联信号放大策略检测黄曲霉毒素b1的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及基于三螺旋dna结合级联信号放大策略检测黄曲霉毒素b1的方法。

背景技术：

2.黄曲霉毒素是一类由黄曲霉和寄生曲霉产生的剧毒次生代谢产物。其中包括黄曲霉毒素b1(afb1)、黄曲霉毒素b2(afb2)、黄曲霉毒素g1(afg1)和黄曲霉毒素g2(afg2)以及代谢产物黄曲霉毒素m1(afm1)和黄曲霉毒素m2(afm2)。其中afb1污染最广，毒性和致癌性最强。afb1广泛存在于多种食品及其原料粮食作物中，玉米、小麦、花生、牛奶和食用油等，因此开发高灵敏的afb1检测方法对食品安全控制极为重要。
3.目前afb1的检测方法主要有液相色谱联用质谱法(hplc-ms)和酶联免疫吸附法(elisa)。hplc-ms虽然作为检测afb1的标准方法，但其检测成本高，需要昂贵的仪器及专业的操作人员。elisa是目前检测afb1的常用方法，具有灵敏度高和选择性好等优点，但抗体的制备周期长，成本高，稳定性不好，极大限制了这类检测方法的应用范围。因此，急需开发一种简便、快速、成本低、高效、灵敏的afb1检测方法。
4.核酸适配体是利用指数富集的配体系统进化技术(selex)从随机单链核酸序列库中筛选出来的dna或rna片段，能够与多种目标物高特异性、高亲和力结合，如金属离子、生物小分子、蛋白质、细胞和细菌等。与传统的抗体相比，核酸适配体具有靶分子范围广、稳定性好、合成简单且易于修饰等优点，在临床诊断、药物分析、食品安全等领域具有很好的应用前景。
5.杂交链式反应(hcr)作为一种恒温无酶的核酸放大技术，被广泛用于发展高灵敏的生物传感新方法。另一方面，脱氧核酶(dnazyme)是一类具有催化活性的核酸分子，依赖特殊的金属离子作为辅酶因子，可以催化切割相应的底物链。脱氧核酶具有高的催化活性、选择性和稳定性，使其成为一种简便的信号放大策略，可用于检测金属离子、核酸分子、蛋白质和小分子物质。

技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测待检样品中是否含有afb1的方法，该方法基于目标毒素的特异性aptamer、杂交链式反应和脱氧核酶，实现级联信号放大，具有灵敏度高，特异性好，准确度高，重复性好的特点。
7.本发明的第一个方面，提供一组检测毒素的探针组，包括aptamer、blocking dna、探针hp、探针h1、探针h2、zn-sub、zn-enz、fluorescent probe和fluorescent probe；
8.所述aptamer为目标毒素的核酸适配体；
9.所述blocking dna与所述aptamer的5'端互补；
10.所述探针hp从5'到3'依次包括：a序列和b序列；
11.所述a序列为同聚嘌呤序列或同聚嘧啶序列；
12.所述b序列与所述blocking dna互补；
13.所述探针h1从5'到3'依次包括：c序列、d序列和e序列；
14.所述c序列与a序列互补；
15.所述d序列为同聚嘌呤序列或同聚嘧啶序列；
16.所述e序列为同聚嘌呤序列或同聚嘧啶序列；
17.所述c序列3'端的碱基与所述e序列互补；
18.所述探针h2从5'到3'依次包括：f序列和g序列；
19.所述f序列与c序列互补；
20.所述g序列与d序列和e序列连接而成的序列互补；
21.所述zn-sub为zn
2+
特异性dnazyme的底物链；
22.所述zn-enz为zn
2+
特异性dnazyme的酶链；
23.所述zn-enz的5'端的碱基与所述d序列3'端的碱基和所述e序列连接而成的序列相同；
24.所述zn-sub从5'到3'依次包括：h序列和i序列；
25.所述zn-enz切割所述zn-sub得到所述h序列和所述i序列；
26.所述i序列3'端的序列为所述c序列5'端的重复序列；
27.所述fluorescent probe与所述h序列互补，且所述quencher probe与所述i序列互补；或所述fluorescent probe与所述i序列互补，且所述quencher probe与所述h序列互补；
28.所述fluorescent probe和quencher probe分别修饰有荧光基团或淬灭基团中的一种。
29.在本发明的一些优选的实施方式中，所述fluorescent probe与所述h序列互补，且所述fluorescent probe的5'端修饰有荧光基团，且所述quencher probe与所述i序列互补，且所述quencher probe的3'端修饰有淬灭基团；或所述fluorescent probe与所述i序列互补，且所述fluorescent probe的3'端修饰有荧光基团，且所述quencher probe与所述h序列互补，且所述quencher probe的5'端修饰有淬灭基团。
30.在本发明的一些实施方式中，所述荧光基团包括tamra、fam、cy3和cy5，所述淬灭基团包括dabcyl、bhq1、bhq2和bhq3。
31.在本发明的一些优选的实施方式中，所述荧光基团为tamra，所述淬灭基团为dabcyl。
32.在本发明的一些实施方式中，所述毒素包括黄曲霉毒素、镰刀菌属毒素、赭曲霉素和青霉毒素中的至少一种。
33.在本发明的一些优选的实施方式中，所述毒素为黄曲霉毒素。
34.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述毒素为afb1。
35.在本发明的一些实施方式中，所述毒素为afb1，
36.所述aptamer的序列为：5'-gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggccc-3'(seq id no.1)；
37.所述blocking dna的序列为：5'-agacaacacgtgcccaac-3'(seq id no.2)；
38.所述探针hp的序列为：5'-acgtgcccaacttcctcagagagaaaagagaggaagaggaagttgggcacgtgttgtct-3'(seq id no.3)；
39.所述探针h1的序列为：5'-ttcctcttcctctcttttctctcttcttctagagagaaaagagaggaa-3'(seq id no.4)；
40.所述探针h2的序列为：5'-agagagaaaagagaggaagaggaattcctctcttttctctctagaaga-3'(seq id no.5)；
41.所述zn-sub的序列为：5'-tttttttgatgcagacgttgaaggatctctctccttctcctt-3'(seq id no.6)；
42.所述zn-enz的序列为：5'-tcttcttctctctcatctagttgagctgtctgcatca-3'(seq id no.7)；
43.所述fluorescent probe的序列为：5'-ccttcaacgtctgcatcaaaaaaa-3'(seq idno.8)；
44.所述quencher probe的序列为：5'-aaggagaaggagagagat-3'(seq id no.9)。
45.在本发明的一些实施方式中，所述fluorescent probe的5'端修饰有tamra。
46.在本发明的一些实施方式中，所述quencher probe的3'端修饰有dabcyl。
47.本发明的第二个方面，提供一种检测毒素的试剂盒，包括本发明第一方面的探针组。
48.在本发明的一些实施方式中，所述毒素包括黄曲霉毒素、镰刀菌属毒素、赭曲霉素和青霉毒素中的至少一种。
49.在本发明的一些优选的实施方式中，所述毒素为黄曲霉毒素。
50.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述毒素为afb1。
51.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括缓冲液。
52.在本发明的一些优选的实施方式中，所述缓冲液pbs(磷酸盐缓冲液)、tris-hac缓冲液和hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液中的任一种。
53.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述缓冲液为tris-hac缓冲液。
54.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述tris-hac缓冲液包括20mm tris(三羟甲基氨基甲烷)、10mm mgac2和200mm naac，ph为7.4，其中ac为醋酸根。
55.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括银离子溶液。
56.在本发明的一些优选的实施方式中，所述银离子溶液为agno3溶液。
57.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述agno3溶液的浓度为150nmol/l。
58.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括精胺。
59.在本发明的一些优选的实施方式中，所述精胺的浓度为160μmol/l。
60.在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括锌离子溶液。
61.在本发明的一些优选的实施方式中，所述锌离子溶液为醋酸锌溶液。
62.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述锌离子溶液中醋酸锌的浓度为2mmol/l。
63.本发明的第三个方面，提供一种本发明第一方面的探针组或本发明第二方面的试剂盒在制备毒素检测产品中的应用。
64.在本发明的一些实施方式中，所述毒素包括黄曲霉毒素、镰刀菌属毒素、赭曲霉素
和青霉毒素中的任一种。
65.在本发明的一些优选的实施方式中，所述毒素为黄曲霉毒素。
66.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述毒素为afb1。
67.本发明的第四个方面，提供一种定性和/或定量检测毒素的方法，包括以下步骤：
68.将本发明第一方面的aptamer与blocking dna混合，然后依次加入待检样品、发夹探针hp、发夹探针h1、发夹探针h2、zn-sub、zn-enz、恒温扩增试剂、fluorescent probe和quencher probe进行扩增，根据荧光强度定量毒素浓度。
69.在本发明的一些实施方式中，所述毒素包括黄曲霉毒素、镰刀菌属毒素、赭曲霉素和青霉毒素中的至少一种。
70.在本发明的一些优选的实施方式中，所述毒素为黄曲霉毒素。
71.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述毒素为afb1。
72.在本发明的一些实施方式中，所述恒温扩增试剂包括银离子溶液、锌离子溶液和精胺。
73.在本发明的一些优选的实施方式中，所述银离子溶液为agno3溶液。
74.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述agno3溶液的浓度为150nmol/l。
75.在本发明的一些优选的实施方式中，所述恒温扩增试剂中精胺的浓度为160μmol/l。
76.在本发明的一些优选的实施方式中，所述锌离子溶液为醋酸锌溶液。
77.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述锌离子溶液中醋酸锌的浓度为2mmol/l。
78.在本发明的一些实施方式中，所述发夹探针hp、所述发夹探针h1和所述发夹探针h2的制备方法为：将直链探针hp、直链探针h1和直链探针h2分别加热升温于85-95℃孵育3-8min。
79.在本发明的一些优选的实施方式中，所述发夹探针hp、所述发夹探针h1和所述发夹探针h2的制备方法为：将直链探针hp、直链探针h1和直链探针h2分别加热升温于88-92℃孵育4-6min。
80.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述发夹探针hp、所述发夹探针h1和所述发夹探针h2的制备方法为：将直链探针hp、直链探针h1和直链探针h2分别加热升温于90℃孵育5min。
81.在本发明的一些实施方式中，所述发夹探针hp、所述发夹探针h1和所述发夹探针h2用pbs(磷酸盐缓冲液)、tris-hac缓冲液和hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液中的任一种稀释。
82.在本发明的一些优选的实施方式中，所述发夹探针hp、所述发夹探针h1和所述发夹探针h2用tris-hac缓冲液稀释，其中所述tris-hac缓冲液包括20mm tris、10mm mgac2和200mm naac，ph为7.4。
83.在本发明的一些实施方式中，恒温扩增体系和扩增条件如下：
84.恒温扩增体系：
[0085][0086][0087]
扩增条件：
[0088][0089]
在本发明的一些优选的实施方式中，恒温扩增体系和扩增条件如下：恒温扩增体系：
[0090][0091][0092]
扩增条件：
[0093][0094]
在本发明的一些优选的实施方式中，恒温扩增体系和扩增条件如下：恒温扩增体系：
[0095][0096][0097]
扩增条件：
[0098][0099]
本发明的第五个方面，提供一种本发明第一方面的探针组或本发明第二方面的试剂盒在食品检测中的应用。
[0100]
本发明的有益效果是：
[0101]
本发明提供了一组探针组，该探针组可以特异性识别目标毒素(afb1等)，基于目
标毒素的特异性aptamer、杂交链式反应和脱氧核酶，实现级联信号放大，完成对目标毒素的高灵敏检测。该探针组具有灵敏度高、特异性好、准确度高和重复性好的特点。此外，该探针对afb1检测的线性范围为0.4-16nmol/l，检出限为0.22nmol/l。
[0102]
本发明提供了一种检测毒素的试剂盒，包含上述探针，能够灵敏、准确和特异性检测样品中的目标毒素含量。
[0103]
本发明提供了一种定性和/或定量检测毒素的方法，该方法步骤简单，成本低廉，灵敏度高，特异性好，准确度高，重复性好，具有较好的应用前景。
附图说明
[0104]
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
[0105]
图1为本发明基于三螺旋dna结合级联信号放大策略检测afb1的方法原理图。
[0106]
图2为本发明检测方法对不同浓度afb1标准品检测的标准曲线。
[0107]
图3为本发明检测方法对afb1的特异性验证结果。
具体实施方式
[0108]
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
[0109]
以下实施例中所使用的实验材料和试剂，如无特别说明，均为常规可从商业途径获得的耗材和试剂。
[0110]
以下实施例中所使用的tris-hac缓冲液含20mm tris、10mm mgac2和200mm naac，ph为7.4。
[0111]
本发明基于目标毒素的特异性aptamer、杂交链式反应和脱氧核酶，实现级联信号放大，完成对目标毒素的高灵敏检测。本发明提供的检测方法原理如图1所示，具体如下：
[0112]
(1)当体系中存在afb1(aflatoxin b1)时：
[0113]
当体系中存在afb1时，afb1会与aptamer特异性结合，使得原本与aptamer结合的互补链blocking dna(封闭dna)释放出来，释放出的blocking dna可以打开体系中的发夹探针hp，使之形成直链模式。探针hp暴露出的茎环部分与探针h1、h2交替循环杂交，引发hcr反应，产生含有重复同聚嘌呤-同聚嘧啶序列片段的dna双链。而体系中的zn-sub和zn-enz的一端也均含有同聚嘧啶序列，可以与hcr产物dna双链上的同聚嘌呤-同聚嘧啶序列片段互补构成三螺旋dna结构。而zn-sub(底物链)和zn-enz(酶链)的另一端具有互补片段，会相互配对形成双链，最终形成“y”型的dna结构，使zn-sub和zn-enz稳定杂交。zn-sub和zn-enz分别为zn
2+
特异性dnazyme的底物链和酶链，在体系中的zn
2+
作用下，zn-sub被脱氧核酶切割为两段后从“y”型的dna结构中释放出来，随后zn-enz继续结合、切割完整的zn-sub，循环往复，从而实现zn
2+
诱导脱氧核酶催化切割反应的信号放大。由于zn-sub被切割后得到的两段序列会分别与体系中修饰有荧光基团的fluorescent probe(荧光探针)和修饰有淬灭基团的quencher probe(淬灭探针)杂交，使两者分别携带的荧光基团和淬灭基团无法靠近，荧光不能被淬灭，因此获得双重放大的荧光信号，实现对afb1的高灵敏检测。
[0114]
(2)当体系中不存在afb1时：
[0115]
由于blocking dna与aptamer互补碱基更多，blocking dna与aptamer互补杂交而
不能打开发夹探针hp，因此无法引发杂交链式反应。此时zn-sub和zn-enz之间互补碱基对不足以使其稳定杂交，故zn-sub不能被脱氧核酶切割，而分别与zn-sub两端杂交的fluorescent probe和quencher probe由于荧光基团和淬灭基团靠近而发生荧光淬灭。
[0116]
上述基于三螺旋dna结合级联信号放大策略检测afb1的检测方法具体包括以下步骤：
[0117]
(1)将20μl aptamer(20nm)和20μl blocking dna(20nm)于ep管中混合杂交，于30℃孵育5min，以形成双链dna；加入5μl待检样品，30℃孵育30min，使afb1与aptamer结合，释放出blocking dna。
[0118]
其中，aptamer的序列为：其中，aptamer的序列为：
[0119]
其中，aptamer序列中标粗部分为blocking dna的互补序列。
[0120]
blocking dna的序列为：5'-agacaacacgtgcccaac-3'(seq id no.2)。
[0121]
(2)继续向ep管中分别加入20μl发夹探针hp(20nm)、20μl发夹探针h1(200nm)和20μl发夹探针h2(200nm)(发夹探针hp、发夹探针h1和发夹探针h2分别由直链探针hp、直链探针h1和直链探针h2在90℃孵育5min冷却后得到，并分别使用tr is-hac缓冲液稀释)，30℃孵育3h，体系中的blocking dna会打开发夹探针hp，使之变为直链，而探针hp暴露的片段会进一步使发夹探针h1、发夹探针h2变为直链并与其互补杂交，引发hcr反应，产生含有同聚嘌呤-同聚嘧啶序列片段的双链dna。
[0122]
其中，直链探针hp的序列为：其中，直链探针hp的序列为：
[0123]
其中，直链探针hp中下划线部分为a序列，标粗部分为b序列。
[0124]
直链探针h1的序列为：直链探针h1的序列为：
[0125]
其中，直链探针h1中标粗部分为c序列，仅标下划线部分为d序列，同时标有下划线和加粗部分为e序列。
[0126]
直链探针h2的序列为：直链探针h2的序列为：
[0127]
其中，直链探针h2中仅标下划线部分为f序列，仅加粗部分为g序列中与e序列互补的部分，同时标有下划线和加粗部分为g序列中与d序列互补的部分。
[0128]
(3)孵育结束后，继续向ep管中加入20μl zn-sub(500nm)、20μl zn-enz(500nm)、5μl agno3(150nmol/l)、5μl精胺(160μmol/l)和5μl醋酸锌(2mmol/l)，30℃孵育3h，使zn-sub和zn-enz分别与体系中的含有同聚嘌呤-同聚嘧啶序列片段的双链dna形成三螺旋dna，有助于zn-sub和zn-enz互补，构成稳定的“y”型结构，在体系中的zn
2+
的作用下，zn-sub被切
割成两部分。其中，agno3和精胺有助于形成稳定的三螺旋dna。
[0129]
其中，zn-sub的序列为：sub的序列为：
[0130]
其中，zn-sub中加粗部分为h序列，仅标下划线部分、同时标有下划线和加粗部分组成的序列为i序列，同时标有下划线和加粗部分的序列为c序列5'端的重复序列；
[0131]
zn-enz的序列为：5'-tcttcttctctctcatctagttgagctgtctgcatca-3'(seq id no.7)；
[0132]
zn-sub被zn-enz切割后得到h序列和i序列。
[0133]
(4)孵育结束后，向ep管中加入20μl fluorescent probe(500nm)和20μl quencher probe(500nm)，30℃孵育1h。步骤(3)中zn-sub被切割后得到的两段序列分别与fluorescent probe和quencher probe杂交，使两者分别携带的荧光基团和淬灭基团无法靠近，荧光不能被淬灭。通过测定体系的荧光强度，并代入标准曲线方程后即可计算出待检样品中的afb1浓度。
[0134]
其中，fluorescent probe的序列为：5'-tamra-ccttcaacgtctgcatcaaaaaaa-3'(seq id no.8)；
[0135]
其中，fluorescent probe与h序列互补。
[0136]
quencher probe的序列为：5'-aaggagaaggagagagat-dabcyl-3'(seq id no.9)；
[0137]
其中，quencher probe与i序列互补。
[0138]
在本实施例中，fluorescent probe的5'端修饰有荧光基团tamra。quencher probe的3'端修饰有淬灭基团dabcyl。
[0139]
基于三螺旋dna结合级联信号放大策略检测afb1的实际检测效果
[0140]
1.绘制标准曲线：
[0141]
使用浓度分别为0、0.4、1、2、3、4、8、12和16nmol/l的afb1标准品溶液作为检测对象，采用上述实施例中的基于三螺旋dna结合级联信号放大策略检测afb1的检测方法进行检测，根据afb1标准品溶液浓度和检测得到的荧光信号强度绘制标准曲线。具体检测步骤如下：
[0142]
向ep管中加入20μl aptamer(20nm)和20μl blocking dna(20nm)，孵育5min；继续向ep管中加入5μl afb1标准品溶液，30℃孵育30min；继续向ep管中分别加入20μl发夹探针hp(20nm)、20μl发夹探针h1(200nm)和20μl发夹探针h2(200nm)，30℃孵育3h；继续向ep管中加入20μl zn-sub(500nm)、20μl zn-enz(500nm)、5μlagno3(150nmol/l)、5μl精胺(160μmol/l)和5μl醋酸锌(2mmol/l)，30℃孵育3h；继续向ep管中加入20μl fluorescent probe(500nm)和20μl quencher probe(500nm)，30℃孵育1h；测定荧光强度，每组样品重复检测三次，取平均值。
[0143]
检测结果如图2所示。
[0144]
由图2可知，当afb1浓度在0.4-16nmol/l时，afb1浓度与荧光强度呈正相关，线性回归方程为：y＝46.862x+221.963，相关系数r2＝0.9994，线性范围为0.4-16nmol/l，检出限为0.22nmol/l(s/n＝3)，其中x为afb1浓度(nmol/l)，y为不同浓度afb1对应的荧光强度。
[0145]
2.实际样品的测定：
[0146]
在本实施例中，所使用的待检样品为含有0.5、2.0和4.0ng/g afb1标准品的花生油。具体检测步骤如下：
[0147]
向ep管中加入20μl aptamer(20nm)和20μl blocking dna(20nm)，孵育5min；继续向ep管中加入5μl待测花生油，30℃孵育30min；继续向ep管中分别加入20μl发夹探针hp(20nm)、20μl发夹探针h1(200nm)和20μl发夹探针h2(200nm)，30℃孵育3h；继续向ep管中加入20μl zn-sub(500nm)、20μl zn-enz(500nm)、5μl agno3(150nmol/l)、5μl精胺(160μmol/l)和5μl醋酸锌(2mmol/l)，30℃孵育3h；继续向ep管中加入20μl fluorescent probe(500nm)和20μl quencher probe(500nm)，30℃孵育1h；测定荧光强度，每组样品重复检测三次，取平均值。将检测结果代入上述实施例中测得的标准曲线中，计算得到含不同浓度afb1标准品的花生油所对应的afb1浓度。
[0148]
检测结果如表1所示。
[0149]
表1：
[0150][0151][0152]
由表1可知，afb1的回收率在92.2％-107.8％之间，相对标准偏差在6.9％-8.7％之间，这表明该方法重复性好，准确性高，可有效用于实际样品中afb1的检测。
[0153]
基于三螺旋dna结合级联信号放大策略检测afb1的特异性检测
[0154]
在本实施例中，所使用的待检样品为afb1标准品溶液、黄曲霉毒素m1(afm1)标准品溶液、赭曲霉毒素(ota)标准品溶液、玉米赤霉烯酮(zen)标准品溶液、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)标准品溶液、伏马菌素(fb1)标准品溶液和t2毒素(t2)标准品溶液，以上待检样品的浓度均为8nmol/l。具体检测步骤如下：
[0155]
向ep管中加入20μl aptamer(20nm)和20μl blocking dna(20nm)，孵育5min；继续向ep管中加入5μl待检样品，30℃孵育30min；继续向ep管中分别加入20μl发夹探针hp(20nm)、20μl发夹探针h1(200nm)和20μl发夹探针h2(200nm)，30℃孵育3h；继续向ep管中加入20μl zn-sub(500nm)、20μl zn-enz(500nm)、5μl agno3(150nmol/l)、5μl精胺(160μmol/l)和5μl醋酸锌(2mmol/l)，30℃孵育3h；继续向ep管中加入20μl fluorescent probe(500nm)和20μl quencher probe(500nm)，30℃孵育1h；测定荧光强度，每组样品重复检测三次，取平均值。
[0156]
检测结果如图3所示。
[0157]
由图3可知，仅afb1组的荧光强度显著升高，其余组的荧光强度与空白组(blank)相近，这表明本方法对afb1的检测具有良好的特异性。
[0158]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。