一种免疫层析试纸条及其制作方法与应用与流程

作者：杨超月

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种免疫层析试纸条及其制作方法与应用。

背景技术：

免疫层析技术是近十年来兴起的一种快速诊断技术，它将传统的免疫标记技术与层析技术结合起来，其原理是以微孔滤膜作为固相载体，以待测液为流动相，利用液体的毛细作用，让待测物向前流动并在检测线发生免疫反应形成免疫复合物，最后通过肉眼或者相应仪器检测，实现对待测物的定性、半定量及定量分析。

免疫层析技术具有检测快速、操作简单等优点，通常在加样后10-20分钟即可得到实验结果，且不需要复杂的检测设备，符合即时检测(poct)的形势需求。

目前常用的免疫层析试剂的方法学主要有胶体金法和荧光法，所用试纸条结构相似，主要包含五个部分：加样区(样品垫)、标记区(标记物结合垫)、显示区(硝酸纤维素膜)、吸水区(吸收垫)以及背衬板。其中，样品垫主要用于过滤样本中的颗粒、调节样本的ph以及结合样本中的干扰物等，若测试全血样本，常需要在这一部分添加滤血膜；标记物结合垫主要装载标记物如胶体金标记抗体、量子点标记抗体等并在有液体上行时稳定的释放这些标记物，并与待测物质结合；硝酸纤维膜(nc膜)主要作用为固化抗原或抗体并且是免疫反应的检测区域，在试纸条制备时会在膜上划上检测线(t线)和质控线(c线)；吸收垫用于控制层析反应中待检测样品持续流动的方向；背衬板则是免疫层析试纸条层叠结构的刚性支持。

在免疫层析试纸条的这5个组成部分中，nc膜上的c线有着不可或缺的作用，其主要用于检测该试纸条是否在控，即试纸条仍然是有效可使用的。在中国专利cn104101708b和cn104237518b中均有提及，质控线上的包被物为针对所述待测物的标记抗体的二抗，这是在现有的层析技术中常用于c线包被的物质，即待测物标记抗体的二抗，若试纸条有效在控，不论待测样本中是否含有待测物，只要液体上行至c线，包被二抗就会和标记抗体发生反应并显色。另一种常用于c线的包被物质为待测物质或者待测物质的重组蛋白，由于标记物垫上的标记抗体都是过量，因此若试纸条有效在控，那么过量的游离标记抗体就会在c线被捕获，与c线上的包被物发生抗原抗体反应并显色。但是，这两种方法都存在一定的弊端：(1)使用二抗作为c线包被物时，由于现在常用的标记物抗体大多为鼠源抗体，因此常用的二抗一般为抗鼠的igg，但是在试纸条制备时常会加入一些阻断剂以消除待检人血液样本中异嗜性抗体带来的干扰，而阻断剂一般有两种，一种是鼠源igg，这就会在检测时与质控线的二抗结合而对检测结果造成干扰，另一种是非igg阻断剂，但这种阻断剂技术壁垒较高，价格昂贵，并不适合诊断试剂生产的大批量使用；(2)使用待测物质或者待测物质的重组蛋白作为c线包被物时，保证了质控线显色结果的特异性与准确性，但是却会加大试剂研发的难度，众所周知的抗原的研发过程难度系数大、研发周期长且价格昂贵，若每个检测项目均需要研发相应抗原，那么不仅会增加试剂研发的周期也会提高试剂开发的成本，这在实际生产中是很难被接受的。

因此，基于上述事实，能够提供一种既能保证质控准确性与特异性又能降低生产成本的免疫层析试纸条的制备方法，是本领域研发人员亟待解决的问题，同时对于免疫层析技术的发展也有着重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种免疫层析试纸条及其制备方法，能够有效保证质控线(c线)指示试纸条有效在控的准确性及特异性，本发明的另一目的是提供这种试纸条在免疫层析体外诊断试剂盒中的应用。

本发明提供了一种免疫层析试纸条，其特征在于，标记复合物上带有用于质控的连接有特殊标签的惰性蛋白，质控线上含有能与惰性蛋白上所带的特殊标签特异性结合的单克隆抗体。本发明的试纸条拥有独立的质控体系，使得测试结果具有更高的特异性和抗干扰性，可以有效避免人血样中自带抗体带来的非特异性反应，更有效的指示试纸条的有效性。

进一步的，本发明所述的惰性蛋白为牛血清白蛋白(bsa)或人血清白蛋白(hsa)。

进一步的，本发明所述的特殊标签为脱氧核糖核蛋白(dnp)、转录终止/抗终止蛋白(nusa)或编码6～10个氨基酸的亲水性多肽(flag)。本发明所选用的特殊标签，在人体内无相似序列或蛋白，在检测时不会造成非特异性反应，抗干扰能力强，准确度高。

进一步的，本发明还提供一种更为具体的试剂条结构，试剂条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和背衬板，所述硝酸纤维素膜贴在所述背衬板上，所述结合垫与所述吸收垫分别搭接在硝酸纤维素膜的两端，所述样品垫搭接在结合垫的另一端；其中，所述结合垫喷涂有标记复合物，所述标记复合物带有能与待检物质结合的抗体或抗原，和带有特殊标签的惰性蛋白；所述硝酸纤维素膜上包括检测线(t线)与质控线(c线)，质控线上的标记抗体为能与惰性蛋白上所带的特殊标签结合的抗体。