单分子定位显微镜

作者：张馨予

单分子定位显微术( SMLM )是一类超分辨率显微技术，用于获得在2 - 25纳米范围内的极高空间分辨率的光学图像。

在过去的十年中，SMLM方法的快速发展使得科学家们能够观察细胞内过程，例如肌球蛋白V在肌动蛋白丝上的移动、单个mRNA转录事件以及病毒内吞的动力学，这些过程一度被认为是不可能被可视化的。

超分辨率显微镜是在19世纪末发现的。在此之前，通常认为分辨两个彼此靠近的显微物体而不是一半波长的光是不可能的。

这是显微镜的“阿贝极限”或“衍射极限”，由于这种极限，科学家无法清楚地观察到小于200 nm (波长为400 nm的远蓝光波长的一半)的结构。

2014年，威廉·默纳、斯特凡·赫尔和埃里克·贝齐格因开发了自由基型荧光显微拷贝而获得诺贝尔化学奖，这种荧光显微拷贝的分辨率远远超过阿贝极限。

斯特凡·赫尔开发了STED (受激发射耗尽)荧光显微术，而默纳和贝特齐格的工作独立地奠定了单分子显微术的基础。

超分辨显微术基于这样的认识，即单个荧光团的位置可以比衍射极限所规定的~ 200 nm范围精确得多。

任何显微镜的分辨力由所用光的波长和物镜的数值孔径或光收集能力决定。由于这两个因素，任何小于衍射极限的点光源都将看起来模糊并且比实际上更大。

仪器的PSF (点扩展函数)是描述这种“模糊效应”或小于衍射极限的物体在某些成像条件下如何出现的特性。PSF的特征是在荧光物体的强度为最大值的50 %的点处测量荧光物体的表观宽度，称为FWHM (半最大值处的全宽度)。

使用FWHM，可以以低至1 nm的精度获得单个荧光分子的位置。这种精度主要受在每个点收集的光子数量的限制，并且等于FWHM除以收集的光子数量的平方根。

虽然可视化稀疏单荧光团是研究特定目标分子动力学的一种很好的方法，但在研究高度密集的复杂生物系统中并不是很有用。在这种系统中获得超分辨率的关键是主动荧光分子的时间分离，这构成了SMLM的基础。

所有的SMLM技术都基于时间调制小组荧光团发射的原理。使用低强度激光束在任何给定时间点随机激活、定位和可逆地或不可逆地漂白少数荧光团；重复此过程数千次可提供高分辨率的细节丰富的图像。

SMLM技术主要不同于所用荧光团的类型，以及用于暂时控制这些荧光团的发射模式的方法。

PALM (光活化定位显微镜)、FPALM (荧光光活化定位显微镜)和STORM (随机光学重建显微镜)

所有这三种技术都使用相同的方法用高强度激光束激活荧光团，随后使用低强度激光随机激发稀疏荧光团组中的荧光。然而，这些技术之间存在若干差异。

PALM和FPALM最初使用蛋白质如PA - GFP (光活化绿色荧光蛋白)作为荧光团，而STORM使用合成碳菁染料Cy3和Cy5。

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此外，在PALM和FPALM中，荧光团通常由细胞表达为标记于感兴趣蛋白的融合蛋白，而内源细胞元件使用标记于风暴中的荧光团的抗体进行免疫标记。然而，在棕榈实验中使用合成染料和在风暴实验中使用荧光蛋白是可能的。

除了这些差异之外，荧光团的寿命通常由于PALM和FPALM中的光活化和光漂白过程而受到限制。

然而，在风暴中，光闪烁现象(其中荧光团在连续激发下在关闭或黑暗状态到打开或发射状态之间随机切换)用于荧光激活的时间分离。

FPALM与PALM和STORM在成像技术上有所不同- FPALM使用传统的共焦荧光显微镜，而PALM和STORM使用全内反射荧光显微镜。

在TIRFM中，选择性地激发与玻璃盖玻片或容器壁接触的细胞/组织表面结合的荧光团；这减少了样品中激发荧光团的数量，使该技术成为单分子检测的理想技术。

冷(三维低温光学定位)

COLD，2016年开发，将荧光显微术带到其基本极限，这取决于荧光团的大小。COLD允许在单个蛋白质分子内的多个荧光位点的亚分子定位，提供埃水平的分辨率。

该技术利用低温减缓荧光团中的光化学反应；这允许在光漂白之前发射更多数量的光子，因此提高了定位精度。荧光团的二维图像可以使用从电子显微镜中借用的算法来重建三维构型。

最新更新日期: 2018年5月29日