干货│免疫共沉淀(CoIP)原理概述及操作流程

作者：杨超月

免疫共沉淀（CoIP）概述及原理

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。

RIPA Buffer配制

基础成分：

Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性）

NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集）

NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液）

去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存）

注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200 mM 的储存液，室温保存）

EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100 mM 的储存液，PH 7.4）

亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）

抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）

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胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1 mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存）

RIPA磷酸（酯）酶抑制剂

激活的Na3VO4（用H2O配制成200 mM 的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protocol）

NaF（200 mM 的储存液，室温保存）

注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂

工作液配制：

配制100 ml 的modified RIPA buffe：

1. 称取790 mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900 mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4。

2. 加10 ml 10%的NP-40 。

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清。

4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存。

5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100 μl； PMSF， Na3VO4， NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

各种成分在工作液中的终浓度：

Tris-HCl： 50 mM， pH 7.4

NP-40： 1%

去氧胆酸钠：0.25%

NaCl： 150 mM

EDTA： 1 mM

PMSF： 1 mM

抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：各1 μg/ml

Na3VO4： 1 mM

NaF： 1 mM

免疫共沉淀技术路线

1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS。

2. 加入预冷的RIPA Buffer（1 ml/107个细胞、10 cm 培养皿或150 cm2 培养瓶，0.5 ml/5×106个细胞、6 cm 培养皿、75 cm2 培养瓶）。

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5 ml EP管中，4℃，缓慢晃动15 min（EP管插冰上，置水平摇床上）。

4. 4℃，14000 g 离心15 min，立即将上清转移到一个新的离心管中。

5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠。

6. 每1 ml 总蛋白中加入100 μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10 min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景。

7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子。

8. （Bradford 法）做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）。