关于密度梯度离心有关问题的补充说明

作者：杨超月

关于密度梯度离心有关问题的补充说明

YU 2005.3

（一）离心管及转头密度梯度制备

① 手工制备；是主要的也是常用的方法

i 阶梯形梯度制备：配置不同密度的梯度液（与离心温度相同），用带恒温装置的阿贝折射仪检测各密度层折射率用于检测密度的正确性，按照由浓至稀薄的顺序分层铺在离心管中；再在梯度液上部或底部铺样品。

ii 线性梯度手工制备：把连续梯度分成（5～10）段不等密度，按照密度的高一低顺序分层铺在离心管中，根据梯度材料不同而在室温中静止存放数小时或过夜；利用梯度材料在重力作用下的浓度扩散形成近线性梯度。

iii 线性梯度冻溶制备；配置平均密度的等密度液，放在低温冰箱中冻结（一般过夜或数小时）全部冻结后取出室温溶化，全部溶化后再放在冰箱中冻结，再静置溶化后可以形成近线性密度梯度。

② 自制简单梯度仪制备：取二个直径相同的玻璃烧杯，请灯工联接底部，联通管的中部加旋塞开关，将最高密度梯度材料和最低密度材料分别置于不同烧杯（注意，二个烧杯中梯度液相加的总容量等于离心管单管梯度液容量）。浓液烧杯中放置螺旋搅拌器，将管道泵的抽出管置于浓杯底部，打开二个杯中间旋塞开关，开动搅拌器及管道泵。抽出至离心管中，直至抽完。这个方法适用于单管容量较大（10ml 以上）的梯度制备、如果管道泵输出有多管分液器，可以用于多管制备，此时二烧杯容量和筹于多管容量之和。

③ 用厂商提供的自动梯度仪制备可以同时制备单管或多管（多至6 管）。如果盛放梯度液的容器直径不同则可以制备曲线梯度，（如高浓度杯直径大，可制备凸指数梯度如低浓度杯直径大，则可制备凹指数梯度。凸指数梯度可提高高密度区分辨率，凹指数梯度可提高低密度区分辨率）

④ 区带转头及连续流转头的密度梯度制备（参考梯度取出第⑦部分说明）

⑤ 利用某些梯度材料在离心过程中自形成梯度的特点制备密度梯度【参考“离心技术讲座”文献第18）】

（二）密度梯度离心后梯度液的取出方法

① 离心管底部穿孔后分滴收集：较大容量注射器针头倒放在空管中（空管内径比离心管外径稍大），离心管顺空管柱下用力刺破管底后松管盖后往下滴液，手工或用计滴（或计时）分部收集器收集后分管作吸光度测量，并绘出容量一吸光度曲线定位。

特点：用于看不清纯样品带的离心；方法简单可行；层次间有少量混浠（特别是低密度液体）影响分辨率；离心管一次使用，成本稍高；适用于薄壁PA，PP， PPCO， PET 管，不适用于PC 管、各种厚壁管、金属离心管及离心瓶；收集后的吸光度测定和容量－吸光度曲线绘制费时、繁复。

② 手工上取：开口管倾斜20°～30°，用定量吸管沿内壁液面处缓缓吸出注入收集管，换吸头再重复吸出，一层层往下收集。

特点；简单可行；一般5ml－40ml 离心管可收集成50～100 管，在容量一吸光度曲践上每收集管有一点。如果梯度离心后会形成三个以上的纯样品带，收集的管数可能要增加到100~200 管才能给绘成比较完整的峰值曲线，和下部穿孔取样一样简单但是非常繁琐，工作量很大；适用于各种离心管、厚壁管、或离心瓶，使用熔封密封管、指压管或快封管时要削去管的肩部以上部分，会影响液柱的整体性。

③ 侧壁穿刺取样：对于可见纯样品带的实验（如质粒DNA，染色体DNA，线粒体等）；可将离心管套在一个开有侧狭缝的空管中用注射器从侧面穿刺进入离心管，缓速抽出。

特点：直接抽出所附要的样品成份；回收率以80％左右；分辨率取决于操作水平；只适用于薄壁的PE，PA，PPCO，PET 管；离心管一次性使用；不适用于不显色的样品。

④ 用特制的取出梯度密封盖，细管插入管底，从上部用蠕动泵泵入高密度排挤液，从密封盖上部侧向开口排出梯度液。梯度取出是从低密度到高密度依次而出。排出口可以联接分光计流动池再接分部收集器，也可以用手工分管收集。

特点：用于开口管，不损坏离心管；密封盖制作比较复什；上部取出次序是从低密度到高密度可以保持较高的分辨率和回收率；一般不用于密封管、快封管和指压管；梯度取出后的流动池连续吸光度测定和联接分部收集器可一气呵成，省时省力。

⑤ 用密度梯度分部制备一收集仪上取：一些厂商提供了自动的多管梯度制备和单管上取收集仪器（如日立的DGF—U），非常适合做开口管的密度梯度上取→分光计流动池吸光度测量→绘制容量→吸光度曲线→自动分部收集的一体化自动取出和测定。自动梯度仪的上取管联接着液面高度探测器，可以自动地在一边往上吸的同时吸管往下移动，它附有管道泵，可以在很大范围内调整抽取速度。

特点：自动化程度高，省时，省力；分辨率和回收率都很好：适用于各种离心管、瓶；用于溶封管，指压管及快封管时只要削去管肩上部一小部分，基本上不影响液柱的整体性；分光计没有流动池时也可以手工收集；仪器还可用于多管（1～6 倍）梯度制备；设备投资稍高。

⑥ 用玻璃毛细管慢慢插入管底，毛细管上部联接蠕动泵软管用蠕动泵抽出再分部收集，或直接联向分光光度计流动池连续测量吸光度并同时绘出曲线，峰值所在即为某几个已纯化的样品所在位置，通过流动池后再用分部收集器或人工收集。

特点：梯度抽出次序是从高密度到低密度，为了减少层间干扰，插入时要缓慢插入和必须缓慢抽出；对各种材料的开口管、厚壁管、离心瓶都可以多次使用（不破损离心管），也可用于快封管、指压管、熔封管（一次性使用管），抽出前须用刀片切去密封口。由于高密度向低密度的抽出往往会引起离心管内不同层次梯度液的混合，降低分辨率，一般不推荐给初次使用者。

⑦ 转头（区带、连续流）密度梯度离心后梯度液的取出：区带转头的梯度制备、加样和梯度取出卸样过程都是在低速运转情况下实现的（2,000~3,000rpm），由特制的密封加样一卸样装置和密度梯度泵来实现密度梯度液的制备和排出。用管道泵输入样品。排出液联到带流动池的分光计后由分部收集器收集。部分超速连续流离心产品（如日本Hitachi 的变频驱动的大容量超速连续流装置CC－40；美国Alfa－Wasserman 公司压缩空气驱动的同类超速连续流装置KII）可以在静止状态下加入梯度液，利用离心机的慢加速把水平梯度转换成垂直梯度然后转头升速至超速（40,000rpm 以下）后连续加样。离心完成后快减速至低转速，慢减速完成转头内液体的垂直梯度向水平梯度转换，停转后从转头下部从部泵出梯度液再联接到分光计流动池检测后自动分部收集。

（三）离心后梯度物质中纯样品区带的检测方法

l 可显色材料（如加E.B. 的质粒DNA 样品带，染色体样品带，线粒体样品带）的直观肉眼观测。

l 某些样品在紫外光照射下显色的直观观察。

l 分部收集后分别用光镜或电镜观察（如细胞、亚细胞构造，病毒等等）。

l 分光光度计流动池（仪器收集）或标准池（人工收集）吸光度测定，容量一吸光度曲线绘制后根据峰位置定位纯样品区带所在的分部收集管。一般核酸，核蛋白体检测用波长260nm；细胞，质膜及亚细胞构造用540nm 都可以获得满意的结果。

l 用放射性同位素标记然后用相应的仪器检测（如液闪计数或γ计数器）。（文献2）

l 用特定的酶标记（如亚细胞构造，细胞器的内膜等）。（文献3）

（四）转头、离心管的选择

l 转头选择：速率一区带（Rate-Zonal）沉降密度梯度离心：选择甩平转头及垂直管转头，大容量选择区带转头。

l 速率－区带上浮密度梯度离心，小容量以甩平转头为主，大容量用区带离心转头；其他各种型式转头（固定角，垂直管，小角度）也可以试用。等密度离心（Isopycinc ）小容量用垂直管转头、大容量区带转头是优选；对于生物大分子的等密度离心可选用小角度或固定角式转头；对于细胞和亚细胞构造及病毒的等密度梯度离心选用甩平转头。（主要选择转速在4 万转/分、容量6×12～13ml 的甩平转头）

l 离心管：选择可以反复使用，梯度制备和梯度取出都很方便的薄壁开口管为主，（PA 管使用最广泛）；各种厚壁管、（可以只加一部分样品，保持最大离心力，缩短离心时间）离心瓶和各种密封瓶为辅。选择离心管应考虑用什么方法制备和取出梯度；材质耐药性和消毒方法；选择何种转头、转速水平及其他因素。要仔细阅读转头样本上每一个转头使用哪些离心管和相应的最高转速、密封方法，（当然这些问题在选购离心机决定配置时就应该考虑周全）。密封管虽然能用到超离最高转速（如l0 万转/分），但因为只能一次性使用，制备和取出梯度较困难，在使用上受到一定限制。开口管和密封管都必须加满和密封。厚壁管可以不加满，某些厚壁管可以在最大容量之内随意加样；离心瓶一般加到肩部以上；用甩平转头时梯度液和样品容量总和的液面应控制在管口下3mm，（离心时液面是弯月面，3mm 的空隙在离心时可使管壁处液面距管口1mm，既不会使液体溢出，又保证了液体支撑住离心管壁而不致于在强大离心力作用下向内翻卷）

（五）其他要注意的问题；

l 梯度上（或下、或中）样品的加样量：为了提高分离的分辨率以保证纯度，加样量一般控制在离心管实际总容量的2％～5％，浓度高的样品加样量少一些，浓度低的样品加样量可以多一些，对连续梯度离心都应控制在这过个范围内。有个例外是使用阶梯梯度分离样品，可以根据实际情况提高加样量。特别是在区带转头中使用阶梯梯度离心。加样量甚至可以高达转头容量的10％～30％（如各种疫苗生产的全病毒或抗原蛋白的纯化制备等）。

l 离心温度的选择和转头预冷：

A：离心温度选择的原则是：

（1）保证被分离样品的品质（特别是酶类样品）常用4℃一5℃。

（2）保证重金属盐在强大离心场中不产生结晶。常用18℃～ 22℃，使用8 万转／分转速以上时用分时段逐级降速的分步离心法，避免结晶生成。

（3）在使用有机溶剂时要保证低温不挥发、或少挥发，不产生气溶胶（当然，也要同时考虑离心管、瓶、适配器和转头的良好密封）。

B：梯度的同温检测：由于配置的同浓度梯度材料的密度，光折射率和粘性系数、渗透率在不同温度时都有很大变化。而一般检验密度值都用阿贝折射仪，所以折射仪应配有恒温设备，设定温度应该与离心温度相同。

C：转头应预冷到接近离心温度。超速离心转头一般不用时都储存在3℃～4℃冰箱内，用于18℃～22℃离心应提前一天取出转头在室温平衡。高速离心应事先把转头放在冰箱内过夜或在离心腔内低速预冷到接近离心温度后再加样。

注意：超速离心转头在部分真空中旋转，与离心腔内壁的传热主要依赖热辐射，在部分真空中对流换热量很小。依靠辐射传热，降温很慢，所以超速离心转头在离心腔内长时间预冷是非常不合理的。超速离心机的制冷系统主要用于抵消在部分真空中高速旋转的转头与稀薄空气摩擦产生的热量，而不是用来冷却温差很大的转头。在任何高、超速离心机实验室中配备低价值的冰箱是非常合理的。超速离心机在较高真空情况下用红外测温可以达到较高的精度（±0.5℃以下），而高速离心机在大气中旋转或在低真空中旋转（1/3～1/2 大气压），无法准确测定转头温度。如果离心机有温度自动补偿软件（即直接显示转头温度），用户随时可知道转头（接近样品）的实际温度。如果用户使用的是没有温度自动补偿软件的离心机，比较合理的处理方法是预冷转头。（如果不预冷转头，这类离心机显示的温度在开始离心的半小时内和转头实际温度相差很大）。

l 防止污染：

A：防止操作过程中接触样品的器具（离心管，管盖，转头部件，连续离心或区带离心的加样系统。各种密封啳，管道）污染样品。它们都必须清洗、消毒，操作人必须戴消毒过的手套加样和卸样。防止酶类降介生物大分子组分，防止各种细菌、细胞污染被分离的样品，防止离心管材料与样品中的溶剂起作用而污染样品或造成离心管破坏等等。当然，用什么清洗剂要严格按照使用说明书或有关资料处理。

B：防止样品污染实验室或者对实验人员造成伤害：－般离心机都不能使用易燃、易爆样品。但如果必须使用时要考虑降低离心温度（减少挥发）和确保离心管、瓶、和转头的密封，绝对不能让易爆、易爆气体扩散到离心腔内。离心有毒、有害样品（病毒、细菌、某些基因等等）、或样品中必须添加有害化学品（如生物大分子离心中加E.B.），操作时除了戴手套、面罩、防护眼镜以外，要特别注意密封操作，离心管加样头、手套一次性处理，实验室内事故冲洗，冲眼设备要齐全。

对毒害样品的离心，加样，卸样，（包括转头密封安装）可以在生物安全柜内进行（超速离心转头有非常好的密封性能。即使由于某种原因离心管损坏，密封失效。操作不当等引起毒害样品漏出离心管但不会漏出转头外）。不要把台式离心机放在生物安全柜内操作。因为生物安全柜有自己特定设计的气流走向，一台低温离心机的制冷系统有多个用于冷却的风扇，强力的排风会影响生物安全柜的气流走向。离心管、离心转头、或适配器加盖密封对防止污染，防止气溶胶扩散有效。离心腔内的毒害性气溶胶会影响实验人员的健康。

l 慢加速和慢减速：为了保证梯度的顺利转换，各类密度梯度离心要求离心机有五档以上的慢加速（0～1000rpm）和五档以上慢减速门（1000rpm～0）。一般的知识是这种慢加、减速速率的调整适用于固定角式，近垂直（小角度），垂直管和区带、连续流转头，实际上对于直径稍大的离心管（如直径大于1cm 的离心管）在低速时（800rpm 左右）由于复合向心力的作用（Coriolis 力），快加速、快减速都会加大这个力的影响，从而影响密度梯度的转换，增宽纯样品区带宽度。而直径1cm 的离心管容量在0.5ml 以卜，常用的离心管都会因直径较大而受到复合向心力的影响。所以，所有的离心管直径较大的转头（包括甩平转头）对于要求较高的密度梯度离心都要选择适度的慢加速、慢减速。

l 预置转速避开离心机的共振区：每台离心机都有自己的自振频率，这个自振频率对不同转头各有差别。由于离心机减震技术的逐步完善，新机型在共振区（运转转速与自振频率相同时）的整机振动感觉已较老机型明显减少，但如果我们把手放在离心机台面上或用耳贴在台面上在加减速过程中转速通过共振区时还是可以感觉到振动或声音的明显区别，尤其是对于较大容量转头或甩平转头，这种感觉更明显。一般离心机都有几个共振频率，设计者往往想通过结构设计和减震器选择把第一（低速）共振区尽可能降低而把第二或第三共振区提高到高于最高转速，但对于转速范围跨度很大的高速、超速离心机，要达到这个理想状态是很困难的。在做密度梯度离心实验时（尤其是低转速的细胞或亚细胞构造分离）使设定转速高于（离心时间缩短）或低于（离心时间延长）共振转速是必要的。对同一转头RCF×T(时间)或ω2t 等于常数，离心效果是一样的。

l 如何看待允许不平衡量：新型的超速离心机由于减震系统的完善；驱动部由于对称管不平衡引起的震动可在相当程度上被吸收，使得主机机架几乎感觉不到不平衡引起的震动，而驱动部寿命也会提高。对称管不平衡要求也由用天平称重降低到肉眼观察液面差在5mm 以内就可以进行正常的离心操作。但由于开口管和密封管（溶封管，指压管，快封管）都要求基本加满，这个条件没有意义。对甩平转头，液面距管口必须保持3mm 空间；这个条件也没有意义。对于厚壁管和离心瓶，这个被放松的条件才有实行的可能。实验结果表明在优良平衡条件下进行密度梯度离心往往有更好的离心效果，操作者可以感觉到在肉眼观察液面差5mm 运转条件和更精确的平衡条件下，在通过共振区（主要是低速）时机组振动感觉的差异。

l 梯度材料的纯度；一般认为分析纯的梯度材料和缓冲液可用于梯度离心，但是问题出在最常用的梯度材料一蔗糖。某些所谓高纯度蔗糖也含有原料植物蛋白和酶甚至还含有金属离子和其他紫外吸收物质。我们可以用活性碳来去除这些什质或者使用纯度有保证的蔗糖。

参考文献：

（1） Miloslav, D. Richard, H “Conditions for density gradient separations”in “Preparative Centrifugation” IRL press OXFORD University press 1992

(2) Hinton ,R.H. 等“Anal.Biochem.” Vol:56 P.270

(3) Hames, B,D 等“Preparative Centrifugations”

Appendix 4, PP 369~387 IRL press 1992

作者：余兴明电话：13764301893,yuxingming@techcomp.cn