单分子FISH技术实现转录组研究的突破

作者：张馨予

分析基因表达，我们有很多选择：qPCR、芯片和RNA-Seq。然而，大多数表达分析往往只关注一个参数：转录本丰度。它们既不能提供空间信息，即特定RNA位于何处；也不能确定细胞之间表达水平的差异，因为细胞群体的研究让这一信息丢失。

原位杂交（ISH）这种显微镜方法解决了这两个问题。它利用标记的核酸探针来确定组织及细胞中DNA或RNA的空间位置和丰度。这种方法有两种形式，荧光（FISH）和显色（CISH）。之前，FISH和CISH一直是定性的：要么阳性，要么阴性。随着技术的发展，定量版本也被开发出来。

单分子荧光原位杂交（smFISH）是一种新的基因表达分析方法，能报告转录本丰度和空间定位。但到目前为止，smFISH还不能实现基因组范围的分析。如今，瑞士苏黎世大学的研究人员报告了一种策略，让smFISH也插上高通量的翅膀。1

苏黎世大学分子生命科学研究所的Lucas Pelkmans领导了这项研究。他解释道，传统的smFISH有两个主要缺点，阻碍了它的高通量应用。首先，它产生相对较弱的信号，信噪比不太高。其次，它不能扩展，因为它需要高的放大倍数，长的成像时间，并且每个转录本的条件需要优化。

传统的smFISH利用一系列短的寡核苷酸来检测转录本，每个寡核苷酸上标记有一个荧光基团。这样，mRNA上就有足够浓度的荧光分子，产生可见的光点，但通常只有在60x或100x放大倍数下，使用油浸、大数值孔径的透镜才行。

Pelkmans及其团队以支链DNA（branched DNA）为基础开发了他们的方法。在这一策略中，15对寡核苷酸探针靶定一个特定的mRNA。这些探针将作为一级preamplifier探针的着陆垫，又为一些二级的amplifier探针提供了结合位点，最后是一组三级的标记探针。

Pelkmans解释道，这就像在转录本上种下了15颗杂交探针的树。这种方法产生了放大的信号，亮度增加100倍，信噪比也提高3倍，而成像时间比传统方法大大缩短。

凭借这种强烈的信号，研究小组将实验过程自动化。他们建立了928个人类基因的支链DNA库，并用培养的HeLa细胞进行了检验。在这一过程中，他们使用384孔板，每孔用一个探针，并使用相同的杂交和洗涤条件。杂交之后，他们以40x放大倍数对每孔中约1万个细胞进行成像，并利用内部开发的算法来提取转录本丰度和空间特征，例如，斑点靠近细胞膜，还是细胞核，集中还是分散。他们总共收集了18个空间变量，并利用计算机集群来评估它们与基因调控的关系。

数据表明，那些表现出相似的空间特征和相似的细胞间差异的基因，也更有可能具有相似的功能作用。

“事实证明，那些空间特征实际上提供了更多信息，可预测基因之间的功能性相互作用，”Pelkmans解释道。

大家都认为，单细胞水平的转录充满噪音。也就是说，细胞质中两个遗传上完全相同的细胞可能有着完全不同的转录本数量。然而，蛋白水平不一定反映这种转录本丰度。Pelkmans认为，生物过程的可靠性有可能源于mRNA亚细胞定位的调节，而他们的数据也支持这一观点。如今，他们的目标是直接检验这一假说，以确定“转录本的空间结构是否缓冲了转录噪音”。

霍华德•休斯医学研究所的项目科学家Timothee Lionnet认为这项研究是“自动化的力作”。他谈道：“他们将FISH技术带到了多重PCR或RNA-Seq技术所达到的通量。”

据Lionnet介绍，这项技术的一个明显延伸是多重检测每个细胞中的多个转录本。两家推出支链DNA技术的公司，Affymetrix和Advanced Cell Diagnostics，目前已经提供多重的FISH探针。据Life Technologies介绍，它将在11月开始销售ACD的smFISH试剂。

之前，加州理工学院的化学家蔡龙（Long Cai）也介绍了一种超分辨率条形码技术，能检测每个细胞中32个不同转录本2。他们利用smFISH技术将单个mRNA与包含独特荧光基团组合的寡核苷酸探针进行了杂交，随后利用超分辨率显微镜计数了这些荧光条形码mRNA。

Pelkmans的团队观察到总体上与RNA-Seq的数据有着良好的一致性，但每个细胞的转录本数量没那么高。他们称之为“天花板效应”。此外，这种技术还不能有效检测核转录本，不过研究人员在固定液中加入乙酸，能减轻这种影响。

参考文献

1. N. Battich et al. 2013. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods 10: 1127–1133.

2. Lubeck, E., and L. Cai. 2012. Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling. Nature Methods 9: 743-748.