超详细！手把手教你做RNA pull down

作者：张馨予

在之前的文章中我们已经了解了RNA pull down 实验的原理、应用、案例和注意事项（回顾点这里），今天我们来唠一唠RNA pull down 实验的详细步骤~

RNA pull down 实验步骤

1、构建 RNA 过表达质粒：基因合成 +测序验证；

2、体外转录模板准备：设计含 T7 启动子引物，PCR 扩增得到转录模板；

3、体外转录：以 PCR 产物为模板，体外转录得到目的 RNA；

4、RNA pull down ：通过磁珠 -RNA 探针复合物富集互作的蛋白；

5、银染质检：SDS -PAGE 电泳银染检测富集蛋白的情况；

6、质谱鉴定：通过质谱鉴定实验组与对照的差异蛋白；进而筛选可能的互作蛋白。

一、构建RNA过表达质粒

1、首先通过其他手段筛选确定自己感兴趣的 RNA （以下讲解lncRNA 为主）；检索数据库找到对应的 RNA 碱基序列；

2、再通过 RACE 扩增是否存在未知序列，由于 lncRNA-RACE 成功率非常低，尝试扩增后再确定 RNA pull down 使用的序列；

3、确认 RNA pull down 使用的序列后，设计引物全基因合成目RNA 序列，构建到 pcDNA3.1（载体可以根据其他实验灵活替换）过表达中，并测序验证序列准确性；

4、最后提取过表达质粒备用。

二、体外转录模板准备

实验分组：

实验组：sense 链即目的 RNA 序列

对照组：antisense 链即目的 RNA 互补序列

引物设计方法：

在正向引物前面加入 T7 启动子序列；反向引物不变。

以构建过表达质粒为模板 +设计合成好的引物，扩增得到体外转录模板，琼脂糖凝胶电泳检测扩增 PCR 产物情况，切取目的条带纯化回收备用。

RNA pull down

三、体外转录

1、以纯化回收的 PCR 产物作为转录模板，用体外转录试剂盒进行转录得到目的 RNA （含 sense 及antisense 两组）；

2、不同试剂盒转录情况（转录RNA 大小、转录 RNA 量等等）会有所不同。

四、RNA pull down

1、蛋白液提前准备：

优先选择细胞系：pull -down 实验前需要提供对应的细胞系，扩大培养后收集细胞裂解提取总蛋白备用；

组织样品作为备选：动物或者植物组织液氮研磨后超声裂解提取总蛋白备用。由于组织样品需要前处理，且其中包含很多杂质可能会对磁珠富集产生影响，最终影响富集效率导致富集蛋白量较少，进而影响最终鉴定结果。

2、以上体外转录得到的 RNA ，标记生物素后纯化备用；

3、标记生物素 RNA 探针与链霉亲和素磁珠共孵育形成复合物；

4、生物素 RNA 探针 -链霉亲和素磁珠复合物富集蛋白；

5、富集蛋白洗脱保存。

五、银染

电泳→固定→致敏→染色→显色→终止

六、质谱鉴定

RNA pull down 富集蛋白质谱通常选择胶条鉴定。

根据银染结果来选择质谱鉴定的方式：

A、存在肉眼可见差异条带：

切取 sense 实验组泳道中的差异条带进行胶鉴定。当差异条带非常多时，节约质谱费用也可以选择 sense 和 antisense 两组蛋白液分别进行质谱。

RNA pull down

B、无肉眼可见差异条带：