抗坏血酸过氧化物酶(APX)测试盒(微量法)

作者：张馨予

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX催化 H2O2氧化 AsA，是植 AsA的主要消耗者。APX的活性直接影响到AsA的含量，APX与 AsA具有一定的负相关性。

测定原理：

APX催化 H2O2氧化 AsA，通过测定 AsA氧化速率，来计算得 APX活性。

自备仪器用品：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 120mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加 3 mL蒸馏水充分溶解。

试剂三：液体 3mL×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL试剂一)进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

测定：

1.分光光度计/酶标仪预热 30 min以上，调节波长到 290nm，用蒸馏水调零。

2.试剂一在 25℃中预热 30min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入 20μL上清液、140μL预热的试剂一 20μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后在 290nm测定 10s和 130s光吸收 A1和 A2，△A=A1-A2。

APX活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA为 1个酶活单位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T=1786×△A÷ Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义：每 g组织每分钟氧化 1nmol AsA为 1个酶活单位。

APX(nmol/min/g鲜重 ) = △A÷(ε×d)×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T=1786×△A÷W

ε：AsA在 290nm处摩尔吸光系数为 2.8×103 L/mol/cm；d：比色皿光径(cm)，1 cm；V反总：反应体系总体积(L)，200μL=2×10-4 L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定，建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积(mL)，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL； T：催化反应时间(min)，2min。

b.使用 96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA为 1个酶活单位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T=3571×△A÷ Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义：每 g组织每分钟氧化 1nmol AsA为 1个酶活单位。

APX(nmol/min/g鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T=3571×△A÷W

ε：AsA在 290nm处摩尔吸光系数为 2.8×103 L/mol/cm；d：96孔板光径(cm)，0.5 cm；V反总：反应体系总体积(L)，200μL=2×10-4 L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定，建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积(mL)，20μL=0.02mL；V样总：提取液体积，1 mL； T：催化反应时间(min)，2min。

注意事项：

配制好的试剂二 4℃保存，并且 3天内使用完。