羟基色氨酸微生物转化浓度的方法与流程

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

1.本发明属于基因工程和生物催化领域，具体涉及一种用于生产l-5-羟基色氨酸的大肠杆菌工程菌的构建及其在提高5-羟基色氨酸微生物转化浓度中的应用。

背景技术：

2.5-羟色氨酸(5-hydroxytryptophan,5-htp)是一种氨基酸类物质,是l-色氨酸代谢的一种产物，也是重要的抑制神经传递素5-羟色胺(血清素,serotonin，5-ht)的前体物质，后者又是作为人体内激素褪黑素(melatonine，mt)的前体物质。摄入5-羟色氨酸能有效帮助产生血清素，因此可促进情绪、神经系统的健康。一些双盲研究表明，5-羟色氨酸可抑制食欲，减少脂肪摄取，减少焦虑，控制情绪，促进睡眠。
3.5-羟色氨酸的制备方式主要是植物提取，来源于非洲的木本攀援灌木加纳(griffonia simplicifolia)的种子。由于加纳籽产量受季节、地理等因素限制，天然提取的5-htp价格波动大，提取成本高。
4.化学合成来制备5-羟基色氨酸的方法主要受限于两个因素，即5-羟基吲哚基团的低成本合成和氨基所在碳原子的手性控制。如在cn102212028a中，5-羟基吲哚基团是由3-甲基-4-硝基苯酚或者以3-甲基苯酚为原料，经多步保护、缩合等反应合成的。而手性的控制则引入了酶拆分的因素。整个过程中保护脱保护步骤，和拆分等成本造成化学合成法不具备价格优势。
5.近年来，微生物转化和发酵法生产成为一条制备5-羟基色氨酸的良好的途径。根据其核心反应中生成5-htp的方式，可分成两类：
6.1.利用l-色氨酸-5-羟化酶(tryptamine 5-hydroxylase,t5h)将l-色氨酸氧化转化为l-5-羟基色氨酸，如cn106414755a，cn101864466a所述。
7.2.利用l-色氨酸合酶(tryptophan synthase)的底物杂泛性，以5-羟基吲哚和丝氨酸(或半胱氨酸)为底物合成l-5-羟基色氨酸，如cn102808008a、angew.chem.int.ed.2016,55,11577
–
11581所述。其中的5-羟基吲哚在生物体内的合成，可以利用邻氨基苯甲酸的羟化后，引入吲哚合成的基本通路实现，如acs synth.biol.2015,4,5,554
–
558所述。
8.此外，根据生物催化反应发生的场所，又可以分为体外酶催化和胞内的发酵或转化。体外酶催化受限于酶的种类，例如目前色氨酸羟化酶都不能在体外大规模重构，只能使用l-色氨酸合酶来合成，但5-羟基吲哚的价格会提高这种方式生产的成本。
9.因此，目前生物法生成5-羟色氨酸大部分是利用全细胞发酵或转化。在目前报道的5-羟色氨酸生成产量上，多为4-8g/l不等，如metab eng.2018jul；48:279-287.；journal of biological engineering volume 12,article number:3(2018)；cn107267417b，cn107164282b等。
10.导致全细胞(发酵)生成产物浓度较低的主要可能原因之一是较高浓度的胞内5-htp对代谢的干扰。细胞缺乏及时将产物转运出去，或维持胞内较低浓度5-htp的自发调节
机制。因此，找到一种主动转运5-羟基色氨酸的策略，是提高5-羟基色氨酸细胞转化(发酵)产量的重要研究方向。

技术实现要素：

11.本发明针对现有技术的不足，本发明首次发现了一种具有转运5-羟基色氨酸功能的转运蛋白，其特征在于氨基酸序列如seq id no.1所示；编码该转运蛋白的核苷酸，其序列如seq id no.2所示：
12.13.本发明提供一种转运蛋白，所述转运蛋白具有如seq id no.1所示的氨基酸序列。
14.本发明提供一种编码权利要求1所述的转运蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸具有如seq id no.2所述的核苷酸序列。
15.本发明提供一种载体，其特征在于，包含如上所述的多核苷酸。
16.优选的，所述载体是大肠杆菌表达质粒。
17.本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如上所述的转运蛋白和多核苷酸，或者包含如上所述的转运蛋白和载体。
18.优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。
19.本发明提供一种提高5-羟基色氨酸微生物转化浓度的方法，所述方法在上述宿主细胞中过表达氨基酸序列为seq id no.1的蛋白。
20.优选的，所述方法以l-色氨酸为底物，色氨酸-5-羟化酶为催化剂。
21.优选的，所述添加喋呤-4α-甲醇胺脱水酶和二氢单喋呤还原酶作为辅酶。
具体实施方式
22.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实验材料
24.如无特别说明，本发明中使用的实验方法均为常规方法，基因克隆操作具体可参见前述sambrook et al.,1989；davis et al.,basic methods in molecular biology(1986)或其它分子生物实验手册。
25.i)试剂：dna聚合酶(primestar max dna polymerase)和t4连接酶购自takara公司，质粒提取试剂盒购自axygen公司，5-羟色胺、磷酸吡哆醛及l-苯丙氨酸、l-色氨酸、l-5-羟色氨酸和l-酪氨酸等试剂都购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
26.ii)载体和菌株：所使用的表达载体为pacycduet-1，质粒购自novagen公司，所使用的宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)，购自天根生化科技(北京)有限公司。
27.iii)测序与引物合成由苏州泓迅巴西vs瑞士让球股份有限公司完成。
28.实施例1：分子克隆
29.设计特异性引物对，在所需突变的氨基酸位置对应碱基引入所需的取代。用提取的大肠杆菌k12野生型mg1655基因组dna为模版，通过pcr扩增出编码seq id no.1。其编码区核酸序列如seq id no.2所述。
30.纯化后的pcr产物经ndei-kpni消化后，与同样位点消化的pacycduet-1载体用t4连接酶连接。连接产物转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，涂布于lb琼脂培养基(含有35mg/l的氯霉素)、挑单菌落至lb液体培养基(含有35mg/l的氯霉素)中培养，提取质粒测序验证突变正确性。提取的质粒置于-80℃保藏备用。
31.实施例2：过表达seq id no.1编码得到的转运蛋白对大肠杆菌中5-羟基色氨酸的生产促进实验
32.将含有的编码工程化细菌色氨酸-5-羟化酶(t5h)、喋呤-4α-甲醇胺脱水酶(pcd)和二氢单喋呤还原酶(dhmr)的5-羟色氨酸生产菌株，制备成化学感受态，再转化入实施例1
中构建的质粒，在含有35mg/l的氯霉素的lb琼脂培养基中培养，挑选单克隆至lb液体培养基(含有35mg/l的氯霉素)中，37℃震荡温育8h。将1ml培养物转接至250ml新鲜的tb液体培养基(含有35mg/l的氯霉素)中，37℃震荡温育至od600达到5左右，将发酵液全部接入装有2.5l发酵培养基的5l发酵罐中。
33.发酵罐培养基配方为(硫酸铵1g/l，磷酸氢二钾12g/l，磷酸二氢钾6g/l，酵母粉5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸钠1g/l，柠檬酸铁铵0.1g/l，消泡剂0.05g/l，氯霉素35mg/l，补料碳源为葡萄糖，使用氨水调节ph)。发酵前期温度为37℃，调整补糖速度使得残糖《1g/l,当菌体od 600约为30时，降温至30℃并加入0.2mm诱导剂iptg，诱导后约3h即可进入催化转化阶段。催化过程中按约0.7g/l/h的速度往发酵罐补入色氨酸-稀盐酸溶液(浓度为100g/l色氨酸)。催化过程中通过增加搅拌轴转速或者增加空气流量来调整溶氧水平10-50％,控制温度30℃，残糖《1g/l。每隔1h通过高效液相色谱分析底物的转化情况，当底物累积浓度超过1.5g/l则放慢补充底物。
34.实施例2的底物转化情况如表1所示：
35.时间/h色氨酸g/l5-羟色氨酸g/l23.20.02428.20.047.11310.198.74340.4810.08370.5211.31400.5812.16430.6213.147.50.1214.9
36.表1
37.实施例3：空白对比实验
38.具体实验流程同实施例2，唯一区别在于，转入的质粒为pacycduet-1空质粒。
39.实施例3的底物转化情况如表2所示：
40.时间/h色氨酸g/l5-羟色氨酸g/l240.963.9927.51.575.2231.21.136.5635.31.257.937.31.288.0140.81.688.1643.52.078.1948.73.018.41
41.表2
42.综合实施例2和3的结果，可以明显观察到，过表达了转运蛋白以后，5-羟色氨酸的生成速度可以保持在较高的水平，而没有过表达该转运蛋白的对照实验中，5-羟色氨酸的转化越来越慢，在8g/l左右则不再继续积累了。可见，seq id no.1编码的转运蛋白能够促
进5-羟基色氨酸的转运，使胞内5-羟基色氨酸的浓度维持在较低水平，从而使发酵液中的产物浓度达到较高水平。
43.本领域技术人员可根据实际情况对上述条件进行一定幅度的调整，并不影响本发明目的的实现。本实施例仅提供一种具体实现方案。
44.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。