茶树谷氨酰胺合成酶基因SSR分子标记引物及应用

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

茶树谷氨酰胺合成酶基因ssr分子标记引物及应用
技术领域
1.本发明属于分子标记技术领域，尤其涉及茶树谷氨酰胺合成酶(gs)基因ssr分子标记引物及应用。

背景技术：

2.茶树是中国重要的木本经济作物，茶氨酸(γ-n-乙基-谷氨酰胺)是茶树中特有的游离氨基酸，不仅是组成蛋白质的基本单位，也是活性肽、酶和其他一些生物活性分子的重要组成成分，是茶叶中生津润甜的主要成分。氨基酸在茶叶加工中参与茶叶香气的香橙，它所转化而成的挥发性醛或者其他产品都是茶叶香气的成分。茶叶氨基酸的组成、含量以及它们的降解产物和转化产物直接影响茶叶品质。
3.谷氨酰胺合成酶(gs，ec 6.3.1.2)是高等植物氮同化过程中的关键酶，在atp存在的条件下，它能催化nh4
+
同化成谷氨酰胺，然后谷氨酰胺在谷氨酸合酶(gogat)的作用下，将酰胺基转移给α酮戊二酸，生成谷氨酸。gs/gogat途径是高等植物将无机氮转化成有机氮的最主要途径。gs存在多种同工酶，广泛分布在高等植物的种子、果实、叶、根、根瘤等器官中。植物的叶片中存在两种gs同工酶，分别是位于细胞质的胞液胞质型gs1和位于叶绿体的叶绿体型gs2，它们在植物体内有着各自不同的功能。
4.目前，水稻、大麦、玉米、豌豆等多种植物的gs基因已经被成功克隆。2008年，rana等分离出1071bp的gs，并对其编码的蛋白进行纯化和鉴定，发现其基因表达量及酶活性在芽叶中较高，老叶其次，茎和根最低。2011年，日本学者tanaka和taniguchi克隆了茶树csgs1；1(ab115183.1)、csgs1；2(ab115184.1)和csgs1；3(ab117934.1)基因。2016年，宛晓春等从“舒茶早”中克隆并分析了gs1-1和gs1-2基因。gs1-1基因全长为2532bp，共编码个氨基酸843个氨基酸，与葡萄的基因同源性为81％，与西红柿的同源性为78％，与毛果杨的同源性为78％。gs1-2基因的orf全长为1071bp，共编码356个氨基酸。安吉白茶等一些茶树的gs基因也已被克隆，但是针对茶树谷氨酰胺合成酶(gs)基因ssr分子标记引物的开发及应用研究还未见报道。

技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供茶树谷氨酰胺合成酶(gs)基因ssr分子标记引物及应用，以便于进一步研究茶树茶氨酸合成以及茶树遗传多态性。
6.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
7.茶树谷氨酰胺合成酶基因ssr分子标记，分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.2的碱基序列，标记编号为ssr1-gs、ssr2-gs。
8.扩增上述茶树谷氨酰胺合成酶基因ssr分子标记的引物，分子标记ssr1-gs、ssr2-gs的引物分别包括具有序列表seq.id.no.3和seq.id.no.4、seq.id.no.5和seq.id.no.6的碱基序列。
9.上述ssr分子标记的制备方法，利用特定引物对茶树总dna进行pcr扩增，得到简单
重复序列；引物包括具有序列表seq.id.no.3和seq.id.no.4、seq.id.no.5和seq.id.no.6的碱基序列。
10.上述ssr分子标记的制备方法，包括以下操作步骤：
11.《1》提取dna
12.采用试剂盒提取茶树的基因组dna作为模板；
13.《2》pcr反应
14.反应体系：反应总体积为20μl，其中2
×
pcr mix 10μl，茶树dna模板1μl，ddh2o 8μl，正向引物和反向引物各1μl；
15.反应程序：94℃预变性5min，接着每个循环94℃高温变性45s，55～60℃退火时间45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸7min，4℃永久保存；
16.《3》电泳显色
17.取5μl pcr产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200v电泳60min；电泳结束后，凝胶用硝酸银进行染色显影。
18.正向引物为序列表seq.id.no.3、seq.id.no.5的引物，反向引物为序列表seq.id.no.4、seq.id.no.6的引物。
19.茶树dna模板为1～50ng，正向引物或反向引物的浓度为10μmol/l。
20.上述ssr分子标记在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
21.上述ssr分子标记在茶树茶氨酸的生物合成研究方面的应用。
22.上述ssr分子标记的引物在茶树的植物种质资源的鉴定、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建、种子纯度鉴定、种群的亲缘关系及演化或遗传育种方面的应用。
23.上述ssr分子标记的引物在茶树茶氨酸的生物合成研究方面的应用。
24.针对目前茶树的茶氨酸合成途径关键酶研究尚少的问题，发明人在
‘
云抗10号’大叶茶树全基因组公开报道的基础上，利用分子标记技术研究开发了茶树谷氨酰胺合成酶基因ssr分子标记(ssr1-gs、ssr2-gs)引物及其应用。研究表明，本发明依据具体特定的基因，在茶树全基因组上开发其ssr引物方法可行，所得引物多态性高、重复性好，具有较好的可行性、针对性。据此，发明人开展了茶树种质资源遗传多态性的研究。综上，本发明的研究方法、ssr分子标记及其引物，可广泛应用于茶树品种鉴定、遗传结构和资源多样性分析、遗传图谱构建，功能基因定位及qtl定位、种子纯度鉴定、分子标记辅助选育种研究中，便于进一步研究茶树茶氨酸合成以及茶树遗传多态性，促进深入开发茶树资源。
附图说明
25.图1是茶树ssr1-gs和ssr2-gs引物扩增片段的聚丙烯酰胺胶电泳图，图中：m：2000bp dna marker；各泳道对应茶种质材料分别为：1，7是德保茶；2，8是黄金茶；3，9是紫鹃；4，10是湘波绿；5，11是金牡丹；6，12是罗香2号。各泳道对应引物扩增片段为：泳道1-6为ssr1-gs引物扩增片段；泳道7-12为ssr2-gs引物扩增片段。
具体实施方式
26.茶树茶氨酸合成途径谷氨酰胺合成酶(gs)基因ssr分子标记研究
27.(1)从ncbi上下载茶树茶氨酸合成途径谷氨酰胺合成酶(gs)基因(genbank:jq925873)基因序列。
28.(2)下载茶树
‘
云抗10号’全基因组序列(下载地址：)。在茶树全基因组中运用ssr search软件寻找其ssr标记，提取ssr序列及其上下游特定长度(默认100bp)的序列。运用primer3进行引物设计，获得引物序列、ssr重复基元和重复长度、预扩增片段长度等。据此合成制备谷氨酰胺合成酶基因相关的50对ssr分子标记引物序列。
29.(3)采用天根生物有限责任公司生产的试剂盒hyqspin tm ct plant dna kit提取德保茶、紫鹃、黄金茶、湘波绿、金牡丹和罗香2号共6个茶树种质资源的基因组dna。
30.(4)从步骤(2)中获得的50对ssr引物中，以步骤(3)提取的6个茶树种质资源基因组dna为模板开展ssr-pcr反应，并利用聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳及快速银染法检测pcr扩增产物。
31.pcr反应体系：反应总体积为20μl，其中2
×
pcr mix 10μl，茶树dna模板(1～50ng)1μl，ddh2o 8μl，正向引物(10μmol/l)和反向引物(10μmol/l)各1μl。
32.pcr反应程序：94℃预变性5min，接着每个循环94℃高温变性45s，55～60℃退火时间45s，72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸7min，4℃永久保存。
33.电泳显色：取5μl pcr产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压200v电泳60min。电泳结束后，凝胶用硝酸银进行染色显影。
34.pcr扩增电泳染色部分结果如图1所示，50对ssr引物中，有2对ssr引物(表1)扩增的片段有差异性，其多态性好、主带清晰。其中，1对位于gs基因5
’-
utr区域，1对位于基因启动子区域downstream。
35.表1基于茶树gs基因筛选获得的2对多态性好的ssr分子标记引物信息
36.