siRNA和shRNA:通过基因沉默抑制蛋白表达的工具
RNA干扰（RNAi）是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA（dsRNA）使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）诱导实现靶mRNA的降解，或者通过小RNA（miRNA）诱导特定mRNA翻译的抑制。这篇综述将重点介绍shRNA和siRNA是如何导致蛋白质表达抑制的。通过几种蛋白的活性（下面讨论），通过短反义核酸（siRNA和shRNA序列）锁定细胞mRNA，从而实现其随后的降解。这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集，导致其水平的下降，最终实现抑制作用。
[放大]
图 1. siRNA和shRNA结构。（A） siRNAs是短的RNA双链，在3‘端有两个碱基的游离。 （B） shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成。（C） shRNA 构建用于插入表达载体。源自 [, ] 。
背景
调控途径的发现和组成元件
早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达。1993年，Nellen和Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。然而，直到1998年，Fire等人发表了在线虫RNA干扰的结果，他们发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。最终确定小RNA途径涉及的蛋白质组分有许多与RNA干扰途径一样。
表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA（siRNA或shRNA）、Dicer酶，Argonaute蛋白家族的蛋白质（具体来说是Ago-2）、Drosha、RISC、TRBP和PACT。
术语 描述
siRNA 小干扰（siRNA），有在3’端有两个碱基的游离，可激活RNA干扰，通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解。
shRNA 短发夹RNA （shRNA） ，包含一个环结构，可加工成siRNA，也可通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解.
Drosha 是一种核糖核酸酶III的酶，可加工细胞核中的前体-miRNA和shRNA。
Dicer 核糖核酸酶III酶，能够将双链RNA加工成在3‘端有两个碱基游离的20-25 bp的siRNA。果蝇的Dicer-2能够剪切长的双链RNA，而Dicer-1对miRNA的加工有重要作用
RISC 最小RNA诱导沉默复合物（RISC） 包含Argonaute蛋白和相关的siRNA。也可能包含PACT、TRBP和Dicer。需要注意的是RISC的组成尚未能得到确切的描述。
TRBP Dicer剪切双链RNA以及随后转运给RISC的过程中需要
PACT 蛋白R（PKR）-激活蛋白（PACT）。Dicer和TRBP参与双链RNA剪切相关.
Argonaute family of proteins 和单链的RNA（siRNA）共同组装形成RISC。绑定21-35个核苷酸的RNA，包括miRNA和siRNA以及相关的靶mRNA，然后通过其内切核酸酶功能发挥剪切作用。剪切作用发生在反义链（引导链）RNA的第10th和第11th个核苷酸之间。
表一：RNAi机制的主要组成元件。
siRNA vs. shRNA作用机制
两个在RNAi途径的基因沉默中具有实质利害关系的是双链小干扰RNA（siRNA）和基于载体的短发夹RNA（shRNA）。虽然siRNA和shRNA（图1）都可用于蛋白沉默，但它们的作用机制有所不同（图2）。不管是长的双链RNA还是短的约21bp碱基对的双链都能够直接被转运到组织培养的细胞中（参见转运机制获取更多细节）。虽然有一些报道提到siRNA在转染细胞时是被转运到细胞核中的，但更普遍的看法是它们在细胞质中聚集。长的双链RNA与Dicer一起形成复合物，双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA。随后这些siRNA片段与RISC结合，RISC由Argonaute-2 （Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白（TRBP）组成。然后RNA的两条链分开，其中一条链从复合物上分离。5'端双链稳定性最低的那条链被选择出来，稳定的并入沉默复合物中。
[放大]
图 2. RNAi介导的基因沉默机制。 在细胞核表达后，shRNA被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白转运到细胞质中，在细胞质中它们与Dicer结合去除环状序列。在这一点上，它们与siRNA的加工方式（以短的双链形态导入细胞，然后被Dicer识别）相同。在与RISC结合并去掉其中一条RNA链后，它们识别mRNA占有互补序列，导致其降解。源自 [] 。
上一篇：《第四军医大学学报》1999年12期
下一篇：生物股份（600201）深度：公司业绩拐点即将显现