化学发光免疫分析新技术研究进展

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

化学发光免疫分析新技术研究进展

肖勤

化学发光免疫分析(CLIA)既具备化学发光反应的高灵敏性，又具有免疫体系的高特异性。该技术因具有分析速度快、线性范围宽、无散射光干扰、无放射性污染、仪器设备简单等优势，在临床诊断、生命分析、环境科学等领域得到了广泛应用。特别是最近几年，随着一些新技术、新材料的发展成熟，CLIA与各种新型材料(纳米材料、量子点、磁性材料等)及新技术(免疫层析、微流控芯片等)的融合促进了化学发光免疫分析突破性的发展。目前对于化学发光免疫分析研究的焦点：一方面增强发光效率，提高检测的灵敏度；另一方面与各种分析技术相结合，探索新的化学发光免疫分析检测方法。本文就近三年来对化学发光免疫分析在化学发光体系、免疫反应中的抗体研发以及化学发光分析与新技术结合方面的探索研究做一综述，以期为 CLIA基础研究及技术开发提供参考。

1 化学发光体系

近年来，在化学发光反应(CL)体系中，对于其催化剂及增强剂的研究日益增多，如酚类化合物、金属离子的络合物、贵金属纳米粒子、碳纳米材料及其它材料对化学发光强度的影响。

1.1 化学发光反应增强剂

由于HRP(Horse radish peroxidase)-鲁米诺(Lumin01)- H202体系是瞬时闪光型，发光强度相对较低，通过加入增强剂以提高其发光强度和延长发光时间的研究由来已久，除常见的酚类化合物如3,4'-噻唑酚、萘酚、对-碘苯酚外。溴酚蓝对HRP-Luminol-H202体系发光强度的增强也已得到证实.目前实验发现：作为感光剂与pH指示剂的溴酚红在传递氧自由基的过程中起到媒介作用，也可做发光增强剂。Yu等(2016)研究证实其在与牛血清白蛋白的共同作用下，可以使HRP-Luminol-H202发光强度快速增加数十倍，优于对一碘苯酚的增强效果.同时，冯志明等(2014)研究证实酚酞啉也可以起到稳定自由基及传递媒介的作用，并避免活性氧自由基之间的相互灭活，可使发光强度增强10倍左右，并持续发光可达20～30 min。

卟啉作为很多重要酶的模拟酶，尤其是金属卟啉配合物具有较高的催化活性。G-四链体DNA与卟啉铁结合的复合物具有HRP催化功能，可催化H202的氧化还原反应。Zong等利用该复合物催化Luminol-H2O2化学发光反应，建立了一种芯片上的蛋白检测方法。但这种分析方法的应用目前还不够广泛，目前还处于一个发展成熟阶段。

还有，Li等(2015)用含Mn3+的卟啉探针(Mn-PyP)催化鲁米诺发光反应来测定血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF的适配体可以使Mn-PyP聚集，阻止Mn-PyP催化鲁米诺发光，当加入VEGF后，由于VEGF与其适配体结合，释放出单体的Mn-PyP，开启发光，达到检测目标物的目的，并且可使目标物的检测限达到pmol/L级。

1.2 贵金属纳米粒子

纳米材料由于介于宏观物质和分子原子之间，表现出来不同于这两者的独特性质，如量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应、宏观两字隧道效应等。当贵金属处于纳米级时表现出很好的催化活性。

金纳米粒子(AuNPs)因易修饰，化学性质稳定，生物相容性好等优点，已经成为纳米催化材料的一个典型代表，在化学发光免疫技术上得到广泛应用。金纳米粒子在CL中有两个方面的应用。一是催化发光反应，二是作为固相载体承载反应的进行。将抗体与高摩尔比的HRP修饰在金纳米粒子上，形成Ab2-AuNP-HRP复合物，可使Lumin01- H202反应发光强度增强，使检测信号放大，在检测免疫球蛋白IgG时，可以使灵敏度比只用HRP标记抗体提高7.4倍.

近几年来，对于标记抗体的金纳米粒子的修饰对化学发光免疫分析影响研究也已经启动。如Shourian等(2015)将生物素通过20个亚甲基(-CH2)修饰在金纳米粒子上，与链霉素标记的二抗结合后，可起到了信号放大的作用，同时鲁米诺也通过10个亚甲基(-CH2)修饰在金纳米粒子上.这些亚甲基的修饰增强了比表面积，也起到了放大信号的作用，使检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)灵敏度提高40倍.