泛素化轴维持调节性T细胞的功能特性

作者：杨超月

日前，浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所/浙江大学转化医学研究院孙毅课题组在《Nature Communications》在线发表论文The Ube2m-Rbx1 neddylation-Cullin-RING-Ligase proteins are essential for the maintenance of Regulatory T cell fitness，发现Ube2m-Rbx1拟素化-泛素化轴维持调节性T细胞的功能特性。Cullin-RING ligases（CRLs）是最大的泛素E3连接酶家族，介导约20%细胞内蛋白质的泛素化修饰。不同成员的CRLs成员由不同的亚基组成，其催化亚基共有两种，分别是Rbx1/Roc1和Rbx2/Rnf7/Sag。孙毅教授课题组前期工作发现，Rbx1或Sag在小鼠的胚胎发育过程中都起到至关重要的作用，无论是敲除敲除Rbx1还是Sag，都会导致小鼠胚胎期死亡，且小鼠胚胎存活时间和死因不同，这表明Rbx1和Sag虽然序列和结构相近，但是并不是功能冗余的，而是具有功能的独立性。
调节性T细胞（Treg细胞）是一类重要的免疫抑制性细胞，对于维持机体免疫稳态，抑制免疫细胞过度活化发挥重要作用；转录因子Foxp3是Treg细胞重要的标志分子。一些Foxp3以外的蛋白质也能够调控Treg细胞的功能。
孙毅教授带领课题组研究人员进一步利用Foxp3Cre-Loxp系统，交配产生Foxp3Cre;Rbx1fl/fl和Foxp3Cre;Sagfl/fl小鼠，在Treg细胞中分别敲除Rbx1和Sag基因。Foxp3Cre;Sagfl/fl小鼠没有明显的炎症反应，小鼠健康可育。Foxp3Cre;Sagfl/fl小鼠在出生后30天左右死亡，并出现严重的炎症反应。Treg细胞中敲除Rbx1引发的表型，与在小鼠中去除Treg细胞引发的表型5非常相似，表明Rbx1在Treg细胞中发挥至关重要的调控作用；同时Rbx1和Sag敲除的区别，也进一步验证了Rbx1和Sag功能上相对独立性。
虽然在Rbx1缺失的Treg细胞，在小鼠出生后逐渐降低；但是在刚刚出生8天的幼鼠体内，Treg细胞比例正常，同时免疫细胞的过度活化就已经很明显了，这表明Rbx1缺失导致Treg细胞免疫抑制功能缺失。
为了深入研究Rbx1对Treg细胞分化的影响，研究人员使用单细胞转录组测序技术，对野生型和Rbx1缺失的Treg细胞进行分析。通过单细胞转录组测序技术，小鼠Treg细胞可以被进一步分解为10余个亚群，其中的两个亚群在Rbx1缺失的Treg细胞中比例明显降低；而这两个亚群高表达多种Treg细胞的关键功能分子，是效应性Treg细胞亚群。Rbx1缺失导致Treg细胞中静稳亚群无法向效应亚群分化。
Rbx1是一种泛素E3连接酶，能够催化底物蛋白的泛素化，促进其降解。为了寻找Rbx1在Treg细胞中的底物蛋白，研究人员对Rbx1缺失的Treg细胞进行了质谱蛋白质组检测，分析到了大量蛋白质丰度的变化。结合转录组分析的结果，研究人员找到了57种蛋白质，在Rbx1缺失的Treg细胞中蛋白质丰度升高，且同时对应的mRNA水平基本不变。这57种蛋白很可能是Rbx1介导泛素化的直接底物，特别是其中一些蛋白质已经被证实能够被Rbx1催化发生泛素化修饰，更证明了本策略是可靠的。
在这57种潜在的Rbx1直接底物中，Bim蛋白也被证实可被Rbx1泛素化并降解，同时Bim与细胞凋亡和Treg细胞都有一定关联，因此猜测Bim的积累，很可能部分介导了Treg细胞中Rbx1缺失引发的表型。在Treg细胞中同时敲除Rbx1和Bim，小鼠仍然发生炎症反应，但是强度较单独敲除Rbx1的小鼠要弱一些。表型挽救实验证实Bim确实部分参与了Rbx1在Treg细胞中的功能。
蛋白质拟素化是一种类泛素化修饰，由类似于泛素化的E1-E2-E3酶促级联反应催化完成；拟素化修饰对于CRLs的活性非常重要，其中拟素化E2耦联酶Ube2m是Rbx1的上游，拟素化E2耦联酶Ube2f是Sag的上游。在Treg细胞中敲除Ube2f，小鼠没有明显的炎症反应，和敲除Sag相似。令人惊奇的是，在Treg细胞中敲除Ube2m，引发的表型要远远弱于Rbx1缺失引发的，表明在Treg细胞中，Rbx1的功能只是部分依赖于Ube2m，与经典观点不同，暗示了Ube2m-Rbx1调控的复杂性。图1 Rbx1和Ube2m在Treg细胞功能调节中的工作模型
浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所吴迪是本文第一作者，孙毅教授是本文通讯作者。本项目蛋白质质谱研究由国家蛋白质科学中心（北京）秦钧教授课题组开展。项目得到了国家重大研究计划、国家自然科学基金和浙江省自然科学基金的支持。
来源 | 转化医学研究院
原标题：《浙江大学转化医学研究院孙毅课题组《Nat Commun》发文揭示Ube2m-Rbx1拟素化-泛素化轴维持调节性T细胞的功能特性》