纯化、繁殖、保存

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

首先是实验步骤：

1.培养液配置

2.细胞传代

3.培养液更换

4.细胞冻存

其中最主要的部分就是进行细胞传代。

什么是细胞传代？

1.传代培养是指将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养的过程。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

2.传代培养中的细胞传代培养（subculture），当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面因细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。

为什么需要进行细胞传代？

1.增加细胞数量

进行不同环境和条件下的细胞培育试验，替换不良和坏死细胞，保持细胞活性。

2.防止细胞中毒和死亡

因为细胞会在培养皿中不断繁殖直到营养物消耗完或代谢物过度堆积，为了保证细胞可以继续繁殖，需要在细胞密度达到80%-90%的时候进行传代处理。如果不进行传代，细胞会因为培养皿中培养物耗尽，代谢物过度堆积，ph值降低等问题而中毒和死亡。

3.纯化细胞

淘汰培养出来的细胞里的占比不大的细胞类型，纯化最终的细胞类型。

实验细胞需要怎样的生存环境？

细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同，需要四项基本条件。

1、无污染环境

无毒和无菌的培养环境是保证细胞生存的首要条件。放置于体外培养的细胞相较于体内细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。

2、恒定的温度

维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃（±0.5℃），偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比;人体细胞在39-40℃中1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复;在40-41℃中1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复;41-42℃中1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。

3、气体环境

气体是人体细胞培养生存的必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95%空气和5%二氧化碳混合气体环境中。

二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。

细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧化碳易逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)因其对细胞的无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变化的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。

4、细胞培养基

培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类;按其来源分为合成培养基和天然培养基。

(1)合成培养基：合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的，内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量无素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽能生存但不能很好的生长增殖。

(2)天然培养基：最普遍的天然培养基是血清，其中小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促粘附因子及其多种活性物质,与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。

具体要细胞传代要怎么做呢

实验前，试剂(培养基，胰酶和PBS)提前30min放入水浴锅加热。