外泌体专题｜Olink超灵敏蛋白质组学加速神经领域

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

　　#外泌体#

　　研究背景

　　细胞外囊泡（Extracellular Vehicles, EVs）是由细胞释放或从质膜伸出/突入外部环境的膜质囊泡。EVs介导许多生物过程、疾病进展、免疫反应、肿瘤形成以及细胞交流。EVs存在多种尺寸（纳米-微米），并根据其尺寸被命名为不同的名称（如外泌体、微囊泡、大囊泡、中间囊泡等）。每种类型的EVs内部都含有核酸和蛋白质（即Cargo）。

　　蛋白Cargo包含代表健康和疾病的重要标志的生物标志物。EVs不仅可以反映来源细胞的内容物，还可以体现来源细胞的生理病理状态，由于其形态小，易透过血脑屏障，在病变早期即发生变化，检测方便，故可作为神经系统疾病非侵袭性的诊断工具，已逐渐成为神经系统疾病相关研究的热点。

　　笔者感悟：

　　目前，由于EVs分离以及获取数量有限，低样本量以及低蛋白浓度，使得基于传统方法EVs蛋白标志物研究，仍然面临较大。近年来，随着Olink PEA技术超灵敏高通量蛋白质组学技术的出现，有望全面表征EVs蛋白特征，给神经系统疾病提供了新的治疗策略。伴随着神经系统相关领域的深入研究，EVs在未来很有可能成为神经系统疾病的诊断和治疗的新型「武器」，在相关临床诊断中具备广阔的应用前景。

　　接下来通过以下案例，小编带大家一起看一看Olink PEA技术如何加速基于EVs神经领域蛋白生物标志物研究。

　　案例一

　　开发细胞外囊泡生物标志物作为区分良/恶性胶质瘤的无创诊断工具

　　在中枢神经系统原发恶性肿瘤中，脑胶质瘤最为常见原发性脑肿瘤，其诊断和治疗也最具挑战性的癌症形式之一。按肿瘤细胞的恶性程度划分：低级别胶质瘤（WHO I和II级），为预后良好的胶质瘤，高级别胶质瘤（WHO III和IV 级），这类肿瘤为恶性肿瘤，预后较差。这类肿瘤良恶性区分，诊断要依赖于手术后的病理诊断，目前依赖于活检或肿瘤切除后获得的组织样本。然而，因为病理诊断手术后并发症（如神经损伤、出血、感染）的风险相当大，使得脑肿瘤是最难以进行活检诊断的肿瘤之一。从而导致肿瘤治疗延迟，并最终导致糟糕的患者结局。已有研究表明，早期发现与诊断脑胶质瘤是提高胶质瘤病人预后的核心环节。因此寻找脑胶质瘤早期诊断、疗效评价及判断预后的指标至关重要。

　　细胞外囊泡作为一种潜在的液体活检生物标志物受到了广泛关注，因为它们代表了「细胞起源的缩影」。来自瑞典隆德大学的研究者使用了尺寸排阻色谱法（SEC）、以及超灵敏的邻位延伸分析技术对脑肿瘤患者群体队列进行研究，寻找肿瘤来源的血浆外囊泡（plEV）蛋白生物标志物，用于良恶性胶质瘤的区分。通过对136例患者在基线（术前）和术后3周（术后），肿瘤治疗开始前采集纵向血浆样本。该队列包括疑似脑肿瘤病变患者（n=136），根据临床常规通过手术和组织病理学检查确定，其中69例患者被诊断为恶性（WHO IV）GBM, 17例患者被诊断为低级别良性（WHO II）星形细胞瘤（以下简称LGG）。

　　通过使用SEC从所有患者中分离plEV，并使用基于PEA技术的超灵敏分析技术对蛋白质组进行检测。研究者同时分析检测了Olink Target 96 oncology II以及CVDIII两个panel中183个蛋白，检测panel是根据已知参与胶质瘤生物学或潜在的外囊泡分类而选择的。使用线性回归并校正年龄（GBM和LGG组之间没有性别差异），共有12个plEV相关蛋白在GBM和LGG组之间存在显著差异（P ），其中一半在98%以上的plEV样本中检出。在调整多次检测时，特别是syndecan-1 （SDC1）在GBM和LGG之间差异显著，而integrin beta chain-2 （ITGB2）表现出强烈的趋势，但不显著。值得注意的是，SDC1和ITGB2是单通道I型膜蛋白，这表明它们是潜在的EV表面生物标志物。

　　为了探讨plEV诊断的准确性，研究者进一步建立了ROC曲线。ROC分析显示，血浆EV-SDC1 （plEV SDC1）可区分GBM和LGG患者，其AUC值为0.81 （95% CI: 0.69-0.93），敏感性为71% （95% CI: 44%-89%)，特异性为91% （95% CI: 81%-97%）。血浆EV-ITGB2 （plEV ITGB2）的AUC为0.77 （95% CI: 0.65-0.88）的敏感性为65% （95% CI: 38%-86%），特异性为71% （95% CI: 58%-81%）。