科学家在植物中开发出新颖的可预测的多核苷酸

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

许多小的调节元件，包括miRNA，miRNA结合位点和顺式作用元件，仅包含5至24个核苷酸，在调节基因表达，转录和翻译以及蛋白质结构中起重要作用，因此是基因功能研究的有希望的靶标和作物改良。

CRISPR-Cas9系统已广泛应用于基因组工程中。在该系统中，由sgRNA引导的Cas9核酸酶产生染色体双链断裂(DSB)，主要通过非同源末端连接(NHEJ)进行修复，从而导致频繁的短插入和缺失(indels)1〜3 bp。然而，这些小插入缺失的异质性使得破坏这些调节性DNA在技术上具有挑战性。因此，精确，可预测的多核苷酸缺失系统的开发对于基因功能分析和这些调控DNA的应用具有重要意义。

由中国科学院遗传与发育生物学研究所的高才霞教授领导的研究团队一直致力于开发新技术，以实现高效和特定的基因组工程。基于胞苷脱氨和碱基切除修复(BER)机制，研究人员开发了一系列APOBEC-Cas9融合诱导的缺失系统(AFID)，该系统将Cas9与人APOBEC3A(A3A)，尿嘧啶DNA-葡萄糖苷酶(UDG)和AP结合裂解酶，并成功诱导了水稻和小麦基因组中新的精确，可预测的多核苷酸缺失。

高教授说：“ AFID-3产生了从5'脱氨基的Cs到Cas9裂解位点的各种可预测的缺失，平均预测比例超过30%。”

研究人员进一步筛选了水稻原生质体中不同胞嘧啶脱氨基酶的脱氨活性，发现截短的APOBEC3B(A3Bctd)与其他脱氨酶相比，不仅显示出更高的碱基编辑效率，而且窗口更窄。

因此，他们用A3Bctd替换了AFID-3中的A3A，生成了eAFID-3。后者从优选的TC基序到双链断裂产生更均匀的缺失，比AFID-3高1.52倍。

此外，研究人员使用AFID系统靶向水稻中OsSWEET14的效应子结合元件，并发现可预测的缺失突变体增强了对水稻白叶枯病的抗性。

AFID系统优于其他当前的工具，可在原型间隔物内生成可预测的多核苷酸靶向缺失，因此有望为基础研究和遗传改良提供强大的缺失工具。

该小组的科学论文标题为“使用APOBEC-Cas9在水稻和小麦中精确，可预测的多核苷酸缺失”，已发表在《自然生物技术》上。