Nature文章揭示DH总黄酮X9与环状RNA形成的关系
3月29日，Nature杂志在线发表了马普学会免疫生物学和表观遗传学研究所Asifa Akhtar教授的Letter文章，介绍发现RNA解旋酶DHX9可特异性结合反向Alu元件，参与调节环状RNA的形成[1]。
该文章的想法怎么来的？
哺乳动物中存在一种针对双链RNA的效应通路，称为dsRNA response。目前已知的这一效应机制的相关基因包括ADAR、PKR、Staufen、MDA-5 和 RIG-I。DHX9的基因结构与ADAR和 PKR非常相似，并且DHX9在细胞在内的含量非常丰富，然而关于DHX9在细胞内的作用研究还非常少。因此，作者开展本项研究的切入点正是要揭示DHX9基因的功能。
图1 DHX9基因结构与ADAR和 PKR非常相似（来自[1]）
文章的主要逻辑思路和结论
DHX9与ADAR和PKR基因如此相似，首先需要分析与DHX9相互作用的RNA序列，找出共性特征。作者分别用uvCLAP和FLASH进行了分析，表明DHX9与Alu元件有较强的相互作用。由于Alu元件是灵长类特有的，作者用小鼠模型分析到小鼠中DHX9主要与B1元件相互作用。这些SINE元件往往形成特殊的RNA结构，DHX9可以捕获的Alu元件间距明显低于未被捕获的Alu元件间距，说明DHX9实际上是通过结合由反向SINE元件形成的特殊双链RNA结构发挥功能的。反向互补RNA序列是形成环状RNA的重要原因，作者在敲除DHX9后环状RNA形成的种类和数量都有非常明显的增加。有些基因的3’-UTR也带有反向互补Alu元件，作者通过构建报告基因系统证明了DHX9也参与调节这类基因的功能。很多基因的转录后RNA剪接过程会受到Alu元件的调控，作者在DHX9敲除细胞的测序结果中发现了非常多的基因的RNA剪接过程受到了影响，作者也选取了有代表性的CCL25基因进行了验证。DHX9基因敲除后还会导致细胞出现奇怪的包含多个小的多形性核的巨细胞结构，通过成像学和相关基因的分析，证明是由于DHX9基因敲除后影响了SPC24基因的功能导致的。最后作者还基于SILIC分析了与DHX9相互作用的蛋白，找到了80多个，通过RNase消化对照，绝大部分是借助RNA的桥接作用在SILIC实验中被钓取到的，有趣的是ADAR的一种剪切变体ADAR(p150) 是不依赖RNA桥接作用的与DHX9相互作用蛋白。最终通过这一系列的深入分析，作者得出结论，DHX9通过与ADAR(p150)相互作用，协同调节RNA转录后加工过程，通过识别以反向Alu序列为代表的反向互补元件形成的RNA双链结构，促进其解螺旋，减少形成环状RNA的倾向，精密的调节基因转录后剪接作用。
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下面我们分别详细介绍本文思路的各个主要部分是如何一步步进行的：
紫外交联法获得DHX9相互作用RNA序列信息
作者采用了紫外交联亲和纯化（uvCLAP）鉴定与DHX9相互作用的RNA，然后分析这些互作序列的共性。
图2 两种紫外交联技术分析DHX9相互作用RNA序列（来自[1]）
作者发现DHX9互作序列集中在内含子区，大部分富集在Alu元件序列上。
图3 DHX9互作序列富集在Alu元件上（来自[1]）
作者也用另一种紫外交联技术（FLASH）验证了这一结论。两种方法相互比较并借助多种分析策略，最终作者得出了DHX9可特异性结合Alu元件的结论。
图4 两种紫外交联分析技术一致表明DHX9倾向于结合Alu元件（来自[1]）
Alu元件为灵长类特有的，在其他物种中DHX9结合什么序列呢？作者构建了内源DHX9插入3×Flag标签的细胞，利用uvCLAP分析，表明小鼠中DHX9倾向于结合B1序列元件。
图5 小鼠中DHX9倾向于结合B1元件 （来自[1]）
DHX9为RNA结合蛋白，Alu元件和B1元件以及果蝇中的roX元件都会倾向于形成特殊的双链RNA结构，从而激发DHX9的功能。在紫外交联的实验中，并非所有的Alu元件都会被DHX9结合，会不会是Alu元件的分布也会影响DHX9的结合？ 于是作者利用工具软件（YASS）分析了DHX9结合与不结合的Alu元件的分布状态，结果表明不被DHX9结合的Alu元件间中位间距达1482nt，而DHX9结合的Alu元件间的中位间距为458nt，差别非常明显，因此作者认为DHX9结合的是适当间距的Alu元件行车了合适的双链RNA结构。
图6 DHX9结合的Alu元件间距分析（来自[1]）
DHX9调节环状RNA的形成
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