【求助】荧光素酶报告基因共转染问题

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

kokoqin
要做蛋白和一个基因启动子的双光素酶报告基因，荧光素基因和内参基因都构建在一个载体上，目前出现几个问题，想问问大家的意见：
1、需要把蛋白过表达质粒和启动子荧光素酶质粒共转染到一个该蛋白阴性的细胞中，做12孔板，两个质粒是共加4ug，报告基因和蛋白过表达质粒的比例如何去摸呢？
2、转染后我还需要加激素刺激才可以是蛋白活化进而激活启动子，可是激素刺激效率达到最大的时间是刺激后48小时，但是转染不也是48小时达到最高效率吗？如果先转染48小时再加刺激48小时，会不会时间有点过长呢？能否在转染第一次换液的时候加上刺激呢？

1、你应该是想得到这样的一个结果：在未加激素刺激之前，你的目标蛋白不会活化并结合到荧光素酶的启动子上；在加入激素后，目标蛋白活化，并启动荧光素酶表达。
问题：未加激素之前的本底荧光素酶表达希望低一些，这样加入激素刺激之后，可以看到一个明显的荧光素酶活性上升，也就说signal window会比较好。所以，我个人觉得，你需要做一个梯度，比如3 ug目的蛋白+1ug荧光素酶、3.5 ug目的蛋白+0.5 ug荧光素酶......。不知道你的启动子有多强，所以你可以先单转染一个荧光素酶载体，然后收集细胞，测一下本底表达，看有多少，根据我的经验，可以考虑RFU在3000-8000之间质粒量（仅供参考）
2、你可以在转染完毕换液的时候就加激素刺激，在第54小时收集细胞进行检测。我之前的经验是，蛋白类因素调控启动子，在6小时的时候就可以检测到荧光素酶的表达变化，既然你的激素是在48小时最大活化目的蛋白，那么在此基础上额外增加6小时，让处于最大活化的蛋白进一步刺激启动子表达荧光素酶。别忘了设定对照哈。
3、其他建议：如果你有很多其他的实验需要用到这个报告系统，建议你把目的蛋白+荧光素酶构建成单克隆的稳定细胞系，这样结果比较有重复性。
以上建议仅供参考哈，实验失败不要来骂我哈。