直流电场对人脂肪间充质干细胞增殖和干细胞生

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells，hASCs)在组织再生和修复过程中发挥着重要作用[-]。由于它们具有自我更新和多谱系分化的能力，被认为是组织工程和再生医学应用的理想细胞来源，特别是分化为骨、软骨和肌肉。然而hASCs的临床应用需要大量的细胞，并且在体外培养hASCs的过程中发现，随着扩增倍数的增加hASCs会逐渐丧失增殖能力和干细胞特性。虽然使用药物刺激等生物化学方法会促进其增殖，但会改变其干细胞特性。因此，在体外培养脂肪间充质干细胞的过程中，如何提高hASCs增殖能力并保持其干细胞特性，是目前亟待解决的问题。

现已知电场刺激是一种用于诱导细胞凋亡、增殖等各种细胞过程改变的物理方法[]。且越来越多的研究表明电场可以影响多种细胞的增殖和凋亡，比如成纤维细胞[]、软骨细胞[]等。并且不同类型的细胞，直流电场影响其增殖的参数不同。目前关于直流电场对脂肪间充质干细胞增殖影响[, ]的研究尚少。而ERK1/2是近年来研究细胞增殖较为广泛的靶点之一[]，抑制该蛋白可显著抑制电刺激诱导的细胞增殖[]。因此，本研究以第三代hASCs为研究对象，设置不同的直流电场参数，观察直流电场对hASCs增殖及其干细胞特性的影响，同时探讨直流电场诱导的hASCs增殖是否与ERK1/2的磷酸化激活有关。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

胎牛血清购自美国Gibco公司，DMEM高糖培养基、胰酶、胰蛋白酶-EDTA、青霉素-链霉素溶液购自美国HyClone公司，Ⅰ型胶原酶、二甲基亚砜购自美国Sigma公司，抗体CD73-PE、CD90-PE-CY7、CD105-APC、CD14-FITC、CD31-FITC、CD34-FITC、CD45-FITC购自美国BD公司，CCK-8购自美国Abmole公司，p-ERK1/2购自美国Cell Signaling Technology公司，GAPDH购自华安生物公司，成骨诱导分化培养基、成软骨分化培养基、成脂诱导培养基购自美国赛业生物公司，细胞培养瓶、培养皿、96孔板、6孔板购自美国Corning公司。流式细胞仪购自美国BD公司，酶标仪购自德国Berthold公司，二氧化碳孵箱、超低温离心机购自美国Thermo公司，荧光倒置显微镜购自日本Olympus公司，恒温摇床购自上海一恒公司。

1.2 组织来源

脂肪组织取自2020年1-10月西南医科大学附属医院整形烧伤外科行腹部及大腿部吸脂术的5例健康成人，年龄18~40岁，体质量指数(BMI)为19~30 kg/m2，并有适当的脂肪沉积，女性要求尿液妊娠实验阴性，并取得知情同意。研究经西南医科大学附属医院伦理委员会审核(KY2021065)。

1.3 直流电场施加设备

该设备由固定在细胞/组织培养室顶盖上的镀金电极组成[]，其中培养室适合标准的6孔细胞/组织培养板(128 mm×85 mm×22 mm；内直径33.78 mm；生长面积8.96 cm2)，便于操作和灭菌，并将培养基蒸发降至最低。每组电极板由13根直径为1 mm镀金电极并联组成(根据6孔培养盒培养孔的尺寸和直流电场的均匀性确定)。并且每组电极板均使用聚甲基丙烯酸甲酯密封，以防止电刺激过程中释放的毒性介质干扰实验结果。从盖子上伸出的电极尖端在并联电路中焊接到镀银铜线上，并通过香蕉连接器连接到标准电源。电量及其应用模式可以通过调节电源来调节。该设备通过用75%乙醇浸泡2 h，用生理盐水冲洗，紫外灯照射下过夜灭菌。

1.4 hASCs细胞的分离、培养

将术中获取的脂肪组织置于无菌的50 mL含有PBS的离心管中，快速送入实验室。将获取的脂肪抽吸物剔除血管杂质，PBS反复冲洗，并剪碎。加入0.1%Ⅰ型胶原酶37 ℃恒温摇床消化，200 r/min离心40 min, 等量体积的完全培养基(高糖DMEM+10%胎牛血清+1%双抗)终止消化，1 200 r/min离心5 min，去上清，沉淀用完全培养基重悬后使用100目的尼龙网过滤，接种在培养瓶中, 置于37 ℃、5%CO2的孵箱中培养，24 h后换液，3~4 d换液。培养7~10 d，根据细胞的融合度决定是否传代。

1.5 hASCs的传代及分组

去掉培养基，PBS洗涤1次，以去除培养基中的血清，加入1 mL 0.25%的胰酶消化2 min, 倒置显微镜下观察到细胞间隙变大、细胞变圆，立即用培养基终止消化，吹打混匀，300×g离心3 min，2 mL培养基重悬细胞，轻轻吹打成单细胞悬液，按1传2的比例传代，当细胞生长融合至70%~80%即可传代。

细胞分为刺激组和未刺激组，刺激组分别给予50、100、150、200 mV/mm直流电场刺激，刺激频率为1 h/d，连续刺激3 d。未刺激组(0 mV/mm)插入电极但未通电。

1.6 细胞增殖检测 1.6.1 细胞计数法