基于氮氧自由基的自旋标记是最受欢迎和最成熟

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

与电子顺磁共振(EPR)光谱结合使用的定点自旋标记(SDSL)已经成为一种经过验证的可靠技术，用于阐明蛋白质和蛋白质复合物的结构，功能和动力学。基于氮氧自由基的自旋标记是最受欢迎和最成熟的标记之一，因为它们小，无干扰并且表现出优异的光谱性质。“理想的自旋标记程序具有很高的反应速率和选择性，”康斯坦茨大学化学系复杂系统光谱学教授Malte Drescher教授和该研究的主要作者，以及专门研究有机合成的Valentin Wittmann教授解释道。

“同时实现高反应性和高选择性可能是一个问题，”Drescher继续说道。“例如，基于钆(III)或三苯甲基的常规自旋标记显示非常宽的光谱和低调制深度或非常窄的光谱，不适合我们想要进行的各种实验。” 由Drescher，Wittmann及其康斯坦茨大学化学家团队发表的一项新研究，于2019年8月14日在线发表在ChemBioChem Communications杂志上，介绍了一种标记蛋白质的新方法，该蛋白质具有基于氮氧自由基的自旋标记和基因编码的非经典氨基酸酸(ncAAs)作为SDSL的靶标。

“氮氧化物提供理想的光谱宽度和获取动态信息的能力，”康斯坦茨化学生物学研究院(KoRS-CB)的博士研究员，该研究的第一作者Anandi Kugele说道，他获得了国家高中着名的旅行补助金。磁场实验室将在美国科罗拉多州丹佛举行的2019年Rocky Mountain磁共振会议上公布结果。“传统的基于氮氧化物的标签具有有限的氧化还原稳定性，这是细胞内应用的一个缺点。我们面临的挑战是增加氮氧化物的稳定性，从而适应基于氮氧自由基的旋转标签，用于未来的常规体内使用。” 为此，研究人员开发了一种新的自旋标记，可以通过逆电子需求Diels-Alder(DAinv)环加成对遗传编码的ncAAs附着到蛋白质上，这种方法已被证明适用于广泛的体外和体内应用。。为了实现氮氧化物的稳定性，研究人员进一步采用了基于光可移动保护基团的保护策略，已知保护基团可保护氮氧化物并根据需要释放它们。

新的自旋标记 - 用于DAinv反应的光活化氮氧化物，或简称PaNDA - 在体外和裂解物测试中都具有水溶性，EPR活性和去保护效率，两种模型蛋白绿色荧光蛋白(GFP)和大肠杆菌氧化还原酶硫氧还蛋白(TRX)，几乎在所有已知的生物体中都有发现。“我们确实需要改进用于向细胞递送PaNDA自旋标记的方法，并测试细胞内的标记和去保护效率，”Malte Drescher总结道：“但我们的研究清楚地表明，原则上， PaNDA 标签可用于在具有挑战性的生物环境中进行EPR测量，包括细胞内部。我们在大肠杆菌裂解液中的测试在这方面非常有前景。这将通过EPR光谱学开辟一系列新的蛋白质研究机会。“

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