【前沿科普】蛋白质氧化折叠：过去、现在和未

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

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责编 | 侯文茹霍麟

一、什么是蛋白质氧化折叠

人体细胞中蛋白质组的大约1/3是分泌蛋白和膜蛋白，包括许多细胞因子、抗体、膜通道和膜受体等。这些蛋白质往往富含二硫键，即肽链上两个半胱氨酸残基侧链的巯基被氧化形成的共价键。形成正确的二硫键对这些蛋白质的结构稳定性和功能完整性十分重要。含有二硫键蛋白质的折叠过程被称为蛋白质的氧化折叠，氧化折叠是最复杂的蛋白质折叠问题。随着半胱氨酸和二硫键数目的增多，可能的配对方式将呈现指数级增长（图1）。在众多可能的二硫键配对形式中，天然态蛋白质只具有其中的一种或有限的几种形式。对许多特化的分泌细胞来说，蛋白质氧化折叠的压力是难以想象的。例如，单个浆细胞每秒可以合成数千个 IgM 五聚体，这需要每秒形成约 105 个二硫键；一个胰岛 β 细胞每分钟可以产生大约 100 万个胰岛素分子，约300万个二硫键。因此，如何高效正确地实现蛋白质氧化折叠对细胞来说是一个巨大的挑战。

图1. 蛋白质氧化折叠问题[1]

随着二硫键数目p的增加，蛋白质分子可能形成的二硫键异构体数目i呈指数级增长。

二、从诺贝尔奖到胰岛素合成--蛋白质氧化折叠的早期研究

最早的蛋白质氧化折叠研究可追溯到二十世纪五六十年代。美国国立卫生研究院的Christian B．Anfinsen根据还原变性的牛胰核糖核酸酶A在去除变性剂和还原剂后，依靠空气氧化就能够自发地形成正确的4个二硫键，重新折叠成天然的三维结构并恢复几乎全部生物活性的实验，提出“多肽链的氨基酸序列包含了形成其热力学上稳定的天然构象所必需的全部信息”，也就是常说的“蛋白质一级结构决定高级结构”的著名论断[2]。Anfinsen因此获得1972年诺贝尔化学奖，开辟了近代蛋白质折叠的研究领域。几乎是同时，1958 年，中国决定启动牛胰岛素人工合成工作。胰岛素是由A链和B链两条肽链通过2个链间二硫键连接起来的蛋白质分子，其中A链还含有1个链内二硫键。邹承鲁先生领导的小组在人工全合成工作中首先解决了胰岛素A、B链二硫键拆合问题，为确定合成路线奠定了坚实的基础，并提出了“天然胰岛素的结构是所有AB异构物中最稳定的结构之一”的重要结论[3]。这无疑是对蛋白质氧化折叠乃至蛋白质折叠问题的重大贡献。

然而，上述研究多是在体外较低的蛋白质浓度和较温和的氧化条件下实现的，一旦蛋白质浓度提高复性产率就会大大下降。另一方面，形成二硫键的反应速度是相对较慢的，这样的速度不能满足机体生命活动的进行。1963年，Anfinsen和匈牙利科学家Brunó F. Straub（后来成为匈牙利国家主席）分别从大鼠肝脏微粒体和鸽子胰脏提取物中找到一种能够有效促进底物蛋白质氧化折叠的物质[4-5]，即蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase, PDI）。20世纪70年代末改革开放初期，“科学的春天”来到，邹承鲁先生重拾胰岛素研究，谓“老题新做”，即胰岛素二硫键拆合成功的基础研究，在中国科学院生物物理所重新扬帆启航。王志珍老师作为其中一名重要的船员，最早成功地用PDI催化胰岛素的正确重组，提出“PDI既是酶又是分子伴侣”的假说[6]，并为此假说提供了实验支持，在国内开辟了分子伴侣和折叠酶研究的新方向。

三、Ero1--催化二硫键从头合成的氧化酶

现在我们知道，蛋白质氧化折叠主要发生在真核细胞的内质网（endoplasmic reticulum, ER）和原核细胞的周质腔（periplasm）中。内质网拥有一整套包括折叠酶和分子伴侣在内的“质量控制”系统为蛋白质氧化折叠提供了保障。就好像北京的地铁，每天要运送超过1000万的乘客，不仅有志愿者作为“分子伴侣”维持秩序，还有安检员负责处理“坏分子”。这样，地铁里的乘客们就能够被纵横交错的地铁网络（很像内质网管状网络）有条不紊地运输到各自的目的地。此外，内质网的谷胱甘肽还原电位（EGSH）约为–200 mV，远高于胞浆中的–300 mV。内质网腔偏氧化的环境也有利于二硫键形成。

PDI只催化巯基和二硫键之间的交换反应，并不增加系统的净氧化。内质网的氧化力从何而来呢？过去很长一段时间，人们认为细胞中的氧化态谷胱甘肽（GSSG）是二硫键氧化的驱动力。体外实验确实证明PDI在GSSG/GSH存在条件下能有效催化底物氧化折叠。但细胞合成的GSH又是如何氧化成GSSG的呢？人们一直在寻找那个能把O2的氧化力转变为二硫键的氧化酶。1998年，美国的两位科学家Chris A. Kaiser和Jonathan S. Weissman利用酵母遗传学筛选手段发现了一个名叫ERO1（ER oxidoreductin 1）的基因，其缺失使得酵母对还原剂十分敏感[7-8]。现在我们知道，ERO1基因编码的Ero1蛋白，是一个从酵母到人保守的巯基氧化酶。Ero1由两个功能区组成：一个包含FAD辅基结合位点和邻近内部活性中心的四螺旋束核心区，以及一个带有外部活性中心的柔性环（也称为“穿梭环”或“调节环”）。外部活性中心从PDI接收电子，像一辆穿梭巴士一样将电子转移到内部活性中心，并通过FAD最终转移到O2，消耗的O2被还原为等摩尔的H2O2分子（图2A）。这一过程又被称为“二硫键接力”，好像接力赛跑一样，一棒一棒地将氧化力从O2传递到底物（电子的流向恰好相反）。据估算，蛋白质氧化折叠过程中因此产生的H2O2可能占到蛋白质合成过程中细胞产生的活性氧的大约25%。因此，Ero1的氧化酶活性需要被精确调控，以适应分泌蛋白合成的需求同时控制氧化应激的风险。