幽门螺杆菌实验室诊断进展

作者：杨超月

幽门螺杆菌实验室诊断进展

　　自从上世纪末Eizzero和Salomon首先在胃粘膜发现螺旋形细菌以来，许多学者对这种细菌做了研究，都未能揭示其病理学意义。直到1983年和1984年，Marshall和Warren从组织上在胃炎和胃肠道疾病患者的胃粘膜发现弯曲菌（CLO），在微需氧条件下培养出CLOs，命名为幽门弯曲菌（Campylobacter pylori-CP），后更名为幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）并证实Hp与慢性胃炎和消化性溃疡密切相关，可能为其病原体。此后，Hp引起胃肠学家、病理学家和微生物学家们的极大兴趣。经过十多年的努力，Hp的实验室诊断从组织学、微生物学、超微结构检查、尿素酶快速诊断发展到13C与14C尿素呼吸试验，血清学免疫抗体检测和聚合酶链反应（PCR）。超微结构检查证实了Hp是慢性胃炎的病原体，尿素酶呼吸试验和血清免疫抗体检测和PCR可作为内窥检查前的筛选，有利于Hp流行病学，发病机理、临床治疗和药物疗效评定研究。

　　1　病史询问和体检

　　详细的病史可发现感染的来源或和胃炎“已知的”原因或弯曲菌感染的关系。主要详细询问动物接触史、旅行、食物、口腔卫生、吸烟习惯、酒精消费量和药物（抗酸制剂药量）。特别是患者的详细病史和症状（上腹痛、恶心和烧心感）及详细的上腹部触诊。

　　2　内窥镜检查

　　内窥镜检查前至少禁食4h，仔细检查胃和十二指肠后进行常规活检，从离幽门2cm～5cm内的窦部或离局灶性损害一定距离的粘膜活检5块标本。当胃粘膜有炎证时应从潮红的区域活检。2块立即固定于福尔马林磷酸盐缓冲液送组织学检查，另2块置于冷却的压氧运送液，在1h内送微生物学实验室培养。最后一块插入“CLO—test box（幽门螺杆菌试剂盒）通过尿素酶活性检Hp。活检标本必要时可送超微结构检查。根据病灶和实验目的不同也可以从胃底和胃体分别活检。

　　3　组织学检查

　　活检标本经石蜡包埋切片后，选用Warthin－Starry、HE，GiemSa、吖啶橙、Gimenez，Brown-Hopps卡宝品红染色法进行染色，然后在光学显微镜或电镜下观察Hp的形态、数量和分布。Warthin－Starrg银染色法是经典的最常用的Hp染色法。Hp是黑色颗粒状外观，可与银沉淀颗粒混淆。Giemsa染色时Hp外观平滑呈纯紫色。虽有背景染色，但细菌形态清晰、染色单一易辨认。Brown－Hopps染色能极清楚地观察胃腔内粘液（黄色或稻草色）里的细菌（紫红色），确定粘液里和粘液外细菌的相对密度和粘液层的厚度，有利于估计入侵细菌的数量，吖啶红是一种能与核酸结合的荧光色素。Hp在表面粘液层腺体表面呈淡桔红色荧光，某种情况下，也可见于细胞内粘液。吖啶橙可以更好地鉴定Hp的特征性形态学。

　　高倍显微镜下，Hp为弧形成螺旋状弯曲样细菌。可根据Hp分布的数量和密度进行半定量测定，Marshall将Hp感染分为四级：0级：无特征性细菌；Ⅰ级：仔细寻找偶有细菌发现；Ⅱ级：大多数高倍视野发现散在分布的或偶有成丛的细菌；Ⅲ级：大多数高倍视野发现大量的细菌。电子为微镜下，Hp是一种长3μm，宽约0.5μm弯曲细长或螺状细菌，包膜光滑，有4根从细菌一端发出的鞘型鞭毛，每根鞭毛有一个终球，每个极没有明显的陷窝压迹。鞭毛和终球称为浆。Hp单一或成丛地分布在胃上皮细胞腔面，包括胃陷窝，常位于粘液深层，接近胃窦上皮细胞平滑膨出的胞浆膜。

　　4　微生物学检查

　　活检标本先涂片革兰色观察Hp，其余组织研碎后接种在绵羊血琼脂或巧克力琼脂，最理想的培养或含万古毒素6mg/L，萘啶酸20mg/L，二性毒素2mg/L，可抑制污染细菌而不抑制Hp生长。Hp需在微需氧条件（CO210％，O25％）温度37℃下培养5d～7d，出现典型Hp菌落为阳性、7d后幼稚菌不生长为阴性。Hp菌落呈直径1mm，没有色素的透明薄层。涂片观察可见Hp为直径约0.5μm，长度2.5μm，外观1或2个波长的螺旋体。某些细菌的鞭毛可见于两端，在阴性染色剂中有球根状尖端。在人工介质中，细菌常比新鲜组织革兰染色中所见的Hp大，弯曲度较小。

　　化生试验：氧化酸＋，触酶＋，H2S＋，尿素酶－，吲哚－，硝酸盐－，不发酵葡萄糖。对萘啶酸耐药。DNA硷基分析鸟甙＋胞嘧啶含量为36mol％，螺杆菌范围的值。

　　5　幽门螺杆菌尿素酶快速诊断

　　Morris et al将一块胃或十二指肠活检标本插入小块尿素琼脂，由于尿素酶的作用，改变琼脂的pH值，使琼脂由黄色变为粉红色，阴性者颜色不变。应用CLO—test，67％Hp感染在15min内诊断，72％1h内，90％3h内诊断。Varira et al改良后4h RUT Hp检出特异100％，敏感性89％。对窦部活检标本的特异性和敏感性分别为100％和92％。假阳性结果可能由于标本里的细菌数量少。他们指出，4h RUT阳性即可开始治疗。Arrinf et al报告Hp的1min尿素酶试验结果，21例标本，19例阳性，没有假阴性报告结果。上述结果表明，Hp感染的尿素酶快速诊断是一种方便可靠的方法。

　　6　13C-尿素呼吸试验