光交联技术的生物应用研究进展

作者：张馨予

光化学反应又称光化作用，一般是指物质在可见光或紫外线照射下，物质分子吸收光子后所引发的化学反应。目前能激活物质分子的光源种类繁多，如红外光、可见光、紫外光、激光等。紫外光一般对光化学反应最为有效；红外光由于能量低，只能引起分子化学键的振动扰动，很难引发化学反应的发生；而可见光常常被用作光化学反应的引发剂，通常是以光敏剂作为媒介，间接地将光能转移到一些可见光不敏感的反应中去，进而引起光化学反应的发生。总之，光介导的化学反应具有操作简单、反应速度快、副产物少等优点，符合绿色化学的要求，受到光化学研究者们的广泛青睐[]。

光交联是光化学反应中目前应用最为广泛的一种反应。光交联反应(也称作光亲和标记，Photoaffinity labeling, PAL)是指将合成的光敏小分子化合物作为工具探针，在特定波长的光照射下，产生高活性的中间体，与其受体活性部位形成特异性的不可逆共价键结合的化学反应。早在1962年，Westheimer等人[]首先提出光亲和标记技术，至今该技术已取得令人瞩目的发展[-]。由于光交联反应具有速度快、条件简单、适合于原位反应等优点，最早主要应用于蛋白质的化学修饰和药物靶标蛋白甄别。之后，光交联反应逐渐被应用于研究蛋白与小分子、生物大分子、蛋白或受体间的相互作用。目前该技术已经成为生物化学家和分子生物学家研究生物体系中空间相邻组分及生物大分子间相互作用的一个重要工具。近年来，随着光学技术与生物医学的不断发展，光交联技术被广泛地应用于化学、生物、材料和医学等领域[-]。

2 光交联反应基团及其作用机制

常见的光交联基团根据其在光照射下生成活性中间体的不同，大致分为四类：氮宾(Nitrenes)类、卡宾(Carbenes)类、碳正离子(Carbocations)和自由基(Radicals)类(如)[]。目前应用最为广泛的光交联基团有苯甲酮、叠氮苯和3-三氟甲基-3-苯基二吖丙啶(3-trifluoromethyl-3-phenyldiazir ine，TFMD)。通常理想的光交联基团应具备以下几个特征：(1)具有一定的化学稳定性，耐受普通的化学反应；(2)在自然光中具有合理的稳定性；(3)黑暗中稳定，在不对样品造成损伤(＞300 nm)的紫外光照下很容易光解；(4)光解后的活性中间体既能与亲核的X-H(X=N, S, O)官能团反应，也能与C-H官能团反应；(5)光解中间体与受体作用得到的产物应该比较稳定，能够耐受分离、纯化和分析等操作。

光交联技术的生物应用研究进展

图 1 光交联反应基团分类[] Fig.1 Commonly used photolabeling reactive species[]

2.1 氮宾(Nitrenes)类

芳香叠氮化合物是最常见的产生氮宾(Nitrenes)类前体的化合物，也是较常用的光交联基团。它的光化学反应机理为：分子在外来光照射下，芳环上的叠氮基团会首先形成单线激发态，然后释放出氮气生成氮宾。氮宾可以是单线态的中间体，也可以经系间窜越形成三线态中间体。单线态氮宾可以对C-H键或者X-H键(X = O, N, S)进行插入反应形成共价键结合的产物，也可以重排为1-氮杂-2-4-6-环庚四烯(didehydrozaepine)或者通过系间窜越形成三线态中间体。三线态中间体以自由基形式吸收质子氢生成氨基化合物或形成偶联产物[]。因此，单线态氮宾具有亲电子活性，是发挥交联作用的主要形式。但是，单线态氮宾只能够稳定存在约100 μs，随后将迅速重排生成比较稳定的烯亚胺，这种烯亚胺分子的反应活性较弱，只能与亲核性官能团反应(如O-H、N-H、S-H等)[]。如果活性位点部分没有亲核性官能团，那就可能迁移到离活性位点较远区域交联，产生非特异性交联。

2.2 卡宾(Carbenes)类

卡宾类分为重氮化合物和双吖丙啶类化合物。重氮化合物与叠氮化合物类似，在紫外光的照射下，重氮基团释放一个N2分子，形成卡宾中间体，随后进攻邻近的C-H键，生成一个新的共价键。该卡宾中间体也会进行Wolff重排，形成烯酮，烯酮再与亲核试剂反应，产生非特异性交联。双吖丙啶基团在黑暗中具有良好的稳定性，同时具有较好的光交联活性。其反应机理：在350 nm或365 nm紫外光的照射下，双吖丙啶基团首先发生共价键断裂，释放出一分子N2，随后键电子重排，形成活性的卡宾中间体，插入到邻近的C-H键或者其他杂原子与H的共价键中，生成新的共价键。这里形成的卡宾中间体半衰期一般在ns级，交联反应非常迅速[]。

2.3 碳正离子(Carbocations)