一种小分子多肽的分离方法：Tricine

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

常规的laemmli-SDS-PAGE分析蛋白质分子质量的范围一般在15-200kDa,对于分子质量小于10 kDa的多肽分离效果差，主要原因是：

1. 小分子多肽在浓缩胶中堆集困难，浓缩效果不佳。

2. 小分子多肽扩散现象严重，表现为带型弥散，并有拖尾现象，影响分离。

传统上采用梯度凝胶来进行分析，但需要高浓度梯度胶，如15-30%梯度胶，并需要专用的梯度灌胶设备，操作非常繁琐。

Tricine-SDS-PAGE的特点：

1. 可应用于5-100kDa范围的小分子多肽和蛋白质。

2. 不使用甘氨酸作为尾随离子，可防止测定样品氨基酸序列及组成的干扰。

3. 使用较低的凝胶浓度，方便后续的电泳转印。

Tricine-SDS-PAGE是对laemmli-SDS-PAGE不连续体系的改进，主要集中在以下方面：

1. 替换了浓缩胶（前导离子-居中离子-尾随离子）中的尾随离子，即以PK值比甘氨酸（pKa29.6）低的三羟基甲基甘氨酸（pKa28.1）作为尾随离子，三羟基甲基甘氨酸（tricine）在电泳中比甘氨酸带有更多的负电荷，在不连续体系浓缩胶中所产生的电位梯度中，迁移速度较快，以加速追赶居中离子（负电荷比tricine尾随离子多的，小于20 kDa的小分子多肽），并对其加强了排斥与推进作用，即增加了堆积浓缩效应。

2. 大幅度增加了胶中及电泳缓冲液的离子强度，浓缩胶缓冲液增加了约6倍，间隔胶和分离胶缓冲液增加了约2.5倍，电泳缓冲液增加了约4倍。采用高离子强度的缓冲液致使电泳中有较多的离子移动而降低了蛋白质的移动速度，通过增加浓缩效应和离子强度的双重作用，可以实现5-20 kDa小分子多肽在较低凝胶浓度（10%，16%）中的分离。

3. 采用不连续的三层胶结构，在常规的浓缩胶与分离胶之间又增加了一层间隔胶（spacergel），即4%大孔浓缩胶+10%小孔间隔胶+16%更小孔分离胶。10%间隔胶的作用是促使电泳条带变窄，并减少扩散，当小分子多肽从大孔浓缩胶移动到小孔间隔胶时，会在进行一定程度的堆集，该作用同样会在小分子多肽从间隔胶移动到更小孔的分离胶时再发生一次。

4. 在分离胶中加入尿素，减少多肽与SDS的结合量，改善小分子多肽的分离效果。