一种阿达木单抗的阳离子交换色谱纯化方法与流

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

一种阿达木单抗的阳离子交换色谱纯化方法与流程

本发明涉及单克隆抗体制备，具体涉及一种阿达木单抗的阳离子交换色谱纯化方法。

背景技术：

阿达木单抗是全球首个被批准的抗肿瘤坏死因子α(TNFα)全人源单克隆抗体。阿达木单抗可阻止TNFα与其细胞表面受体结合，从而阻断TNFα的生物学活性，最终减轻炎症反应并减少破骨细胞激活，达到控制并缓解症状体征的目的。

传统纯化方法如中国专利CN 102257006 A，公开了通过亲和层析捕获步骤分离和纯化抗体的方法，Protein A柱由于选择性高和去污染物能力强，经常被首选进行抗体捕获，但其价格昂贵、洗脱的低pH易导致高分子聚合物形成、Protein A配基掉落等缺点，使越来越多的研究开始关注用非ProteinA工艺来解决现有问题。中国专利CN 103998469 A公开了用阳离子交换柱、疏水相互作用柱和阴离子交换柱来替代Protein A柱去除抗体污染物。其中，具有改进载量的阳离子填料可用来处理发酵后处理的料液，但料液在加载到特定柱上后，由于污染物含量较高，吸附到色谱柱产生竞争会影响层析中多聚体去除，给后续纯化中多聚体的去除带来不便。中国专利CN 102119168 A公开了一种使用非离子聚合物的层析步骤去除蛋白质聚集物，随后使用强化溶解的添加剂进行离子交换层析，但使用的添加剂浓度偏高，用在抗体纯化过程中，有导致抗体变性失活的风险。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现有技术的缺陷，提出一种能够有效去除多聚体等污染物和稳定样品的阿达木单抗的纯化方法。申请人在研究中发现，在复性过程中添加的辅助因子(如尿素和表面活性剂等低浓度变性剂)能够通过提高折叠中间体或伸展肽链的延展度来抑制聚集体生成。而这些辅助因子除了能更好地去除多聚体，本身还有稳定抗体高级结构的作用，抑制多聚体的形成。因此，在色谱操作中引入多步冲洗和洗脱，并在洗脱缓冲液中加入适当的添加剂，能够有助于去除多聚体等污染物和稳定样品。根据上述发现，申请人提出了如下技术方案：

本发明的技术方案提供了一种纯化阿达木单抗的方法，包括对CHO细胞发酵表达的抗体进行阳离子交换色谱洗脱、疏水作用色谱洗脱。阳离子交换色谱的洗脱液是pH 5.5-6.5的缓冲液，共进行2次洗脱，其中第一次阳离子交换色谱的洗脱液中含有0.1-0.5mol/L尿素；第二次阳离子交换色谱的洗脱液中含有质量分数0.1％-1.0％的甜菜碱类表面活性剂；所述的疏水作用色谱洗脱分为2步洗脱，其中，第一步洗脱的洗脱液为pH5.5-6.5、0.15-0.4mol/L(NH4)2SO4的45mmol/L PBS缓冲液，第二步洗脱的洗脱液为pH5.5-6.5的45mmol/L PBS缓冲液。

根据上述技术方案提供的方法，在一些实施方式中，所述的甜菜碱类表面活性剂选自十二烷基二羟乙基甜菜碱、十八烷基二羟乙基甜菜碱或椰油酰胺丙基甜菜碱。

本发明在阳离子交换色谱的洗脱液中引入了低浓度尿素和甜菜碱。尿素一般用于包涵体复性时溶解包涵体的作用(8M)，而低浓度的尿素可使蛋白复性，有利于折叠成天然构象。同时适当浓度表面活性剂能与吸附剂及蛋白的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附，甜菜碱类两性离子表面活性剂，表面含有两性离子基团或阴阳离子端基基团混合物，带电两性离子官能团的溶剂化作用和氢键作用能使两性离子化合物表面形成水合层，这种基于静电作用形成的水合层表面可有效阻抗非特异性蛋白吸附。

HIC(疏水相互作用层析)是一类根据层析填料表面配基与蛋白质表面疏水残基之间的疏水性差异而对蛋白质进行分离的层析方法。蛋白质的疏水性表面残基能够与HIC基质上的配基相互作用，而结合强度会根据表面所暴露残基的疏水性不同而有所差别。一般情况下，疏水性作用随离子强度提高而增强，因此在HIC过程中通常采用“高盐吸附，低盐洗脱”。在合适的条件下，结合的蛋白质按照疏水性逐渐增加的趋势洗脱。多聚体通常是多个单体蛋白质的聚合或者涉及变性蛋白，其疏水性比单体更强，因而HIC可用于多聚体的去除使其在洗脱过程中更晚出峰而与单体分离。

本发明中的数字均为近似值，无论有否使用“大约”或“约”等字眼。数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％等差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值的数字会被明确地公开，其中“+/-”是指加或减，并且N-10％到N+10％之间的范围也被公开。例如，对于“第一次洗脱的洗脱液含0.2mol/L尿素”，则有0.2mol/L+/-1％，0.2mol/L+/-2％，0.2mol/L+/-3％，0.2mol/L+/-5％，0.2mol/L+/-7％，0.2mol/L+/-8％和0.2mol/L+/-10％的值被同时公开，同时，0.2mol/L-10％到0.2mol/L+10％之间的浓度范围也属于公开的范围，亦即0.18-0.22mol/L及其之间的值，都在第一次洗脱的洗脱液的包含范围内。