转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号外源基因整合分析

作者：杨超月

自1996年以来，全球转基因农作物商业化种植面积和销售收入均以倍数增长。水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，目前，全球转基因水稻研究进展迅速，我国转基因水稻研发与世界同步，成功培育出抗螟虫、抗除草剂、耐盐、氮磷高效转基因和优质等系列转基因水稻品种/品系，为我国转基因水稻的产业化提供了技术和品种储备[]。

通过转基因技术可以将外源基因导入到受体中，改良目标农艺性状。外源基因的插入改变了一个基因与其邻近基因或其邻近染色质的位置关系，随着外源基因的整合区域的不同可发生位置效应，从而影响宿主植物的特定功能及表型。因此，研究T-DNA插入位点的旁侧序列及其插入位点就显得尤为重要[]。利用农杆菌遗传转化方法导入的外源基因在宿主基因组的插入位点是随机的，每个转化事件中外源基因和基因组DNA拼接组成的旁侧序列具有唯一性。因此，T-DNA旁侧序列分析一直是转基因植物研究的热点，它对于阐述T-DNA整合方式、染色体定位、转基因表达活性等具有重要意义。T-DNA整合过程是个复杂的异常重组过程，包括植物基因组整合位点的删除和重复，T-DNA序列的删除和重复，以及染色体上的易位和到位等现象[-]。

染色体步移（Chromosome walking）是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法。分离旁侧序列的染色体步移方法主要采用基于PCR扩增的染色体步移技术中的半随机引物PCR策略。半随机引物PCR策略中的热不对称交错PCR（Tail-PCR）是将目标序列旁的已知序列中设计的3个嵌套的特定引物（Special primer SP1，SP2，SP3）分别与1个具有低Tm值的随机简并引物（Arbitary degenerate Primer，AD）相结合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异产物的方法，该方法准确性高、操作相对简单[]。

根据所分离的旁侧序列，通过与NCBI的比对分析确定T-DNA在基因组中的整合位点。该序列是不同转基因作物品系的特异性身份标识，根据其建立的品系特异性检测方法能快速、准确地鉴定不同转基因作物品系[-]，保证了转基因作物检测的准确性和专一性，为监管转基因作物的育种、生产、加工和销售提供了可靠的技术支撑[-]。利用外源基因在受体基因组上整合位点的唯一性，可以建立品系特异性检测方法，该方法可根据外源DNA与旁侧植物基因组连接区序列为靶标设计引物，利用PCR方法扩增出对照和转基因品系特异的PCR条带[]。

Bt抗虫基因cry1C所编码的杀虫蛋白可以抑制和杀死鳞翅目害虫，是在野生型Cry1Ca5基因的基础上通过序列优化人工合成的抗虫基因[]。目前，利用生物技术手段将cry1C基因导入到各种植物中，包括水稻[-]、大豆[-]、玉米[-]等作物，成功获得了对抗鳞翅目害虫具有抗性的转基因植物。前期研究中，我们利用农杆菌介导的遗传转化方法，将cry1C基因导入到水稻品种吉粳88中，获得了抗虫转基因水稻吉生粳3号[]。本研究旨在通过染色体步移方法获得吉生粳3号的左、右边界旁侧序列，依据旁侧序列确定T-DNA在基因组中的插入位点，并建立吉生粳3号品系特异性PCR方法，为吉生粳3号的身份识别提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

转基因水稻吉生粳3号由本课题组培育保存；非转基因水稻吉粳88由吉林省农业科学院水稻研究所提供。

1.2 方法 1.2.1 基因组DNA的提取

将种子播种在1/2MS培养基中，7 d后取样保存。采用CTAB方法提取0.1g水稻样品中的基因组DNA[]。DNA样品的纯度和浓度用NanoDrop进行检测。

1.2.2 转基因植株吉生粳3号的Southern Blot

利用CTAB法提取水稻叶片的基因组DNA，利用DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I（Roche公司）进行Southern杂交，方法参考试剂盒说明书。具体步骤为：取60 μg基因组DNA，用限制性内切酶Sac Ⅰ（TaKaRa）进行完全酶切。酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离后转膜（Amersham），用地高辛标记的cry1C探针进行杂交，再用X-光胶片化学发光自显影。

扩增探针引物序列为：cry1C-F：5'-TTCTACTG-GGGAGGACATCG-3'，cry1C-R：5'-CGGTATCTTGG-GTGATTGG-3'。

1.2.3 转基因水稻吉生粳3号的右边界旁侧序列的获取

采用染色体步移试剂盒（TaKaRa GenomeWa-lking Kit，Code No.6108）分离吉生粳3号中外源载体插入位点处的旁侧序列。在已知的T-DNA序列右边界设计3条同向且退火温度较高的特异性引物（）。

表 1 T-DNA右边界巢式引物序列

以1 μL（200 ng左右）吉生粳3号基因组DNA为模板，使用右边界特异性引物和试剂盒中的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4进行巢式PCR。