单链DNA介导的人工限制性内切酶PfAgo或可用于捕获

作者：张馨予

限制性内切酶是一识别DNA序列并在识别序列或识别序列附近进行切割的细菌蛋白。大多数限制性内切酶如II型限制酶，只能识别较短的DNA序列（如4-8bp），这大大限制了这种酶在DNA重组技术中的应用。为了克解决以上难题，已有相关蛋白质工程研究工作被报道，如通过将DNA结合域与核酸酶域（锌指头结合蛋白ZFNs或类转录激活子核酸酶TALENs）融合而成的人工限制性内切酶(Artificial restriction enzymes, AREs)；或在体外利用CRISPR-Cas9系统设计的AREs。这些已报道的AREs具有比天然存在的限制酶更高的特异性，但它们切割DNA之后并不能生成明确的黏性末端或平末端，并且这类AREs的活力不高。基于这些因素，限制了已报到的AREs在体外的应用。

Argonaute是一类可结合在短的核苷酸序列上的蛋白，它在所有生物中都很保守。在真核生物中，Argonaute蛋白参与了RNA沉默或者RNA向导的RNA切割；而在原核中，Argonaute蛋白可以在短的DNA序列的引导下切割ssDNA或ssRNA。而近期，来自伊利诺伊大学的研究人员，借助来自古细菌Pyrococcus f uriosus里的Argonaute（PfAgo），以5’端磷酸化的ssDNA为向导，实现了分子克隆和DNA fingerprinting。据研究人员介绍，PfAgo能够切割靶定DNA序列形成明确的黏性末端，在切割过程中，先将PfAgo、ssDNA及线性双链DNA孵育在87-98 °C高温环境下，PfAgo在ssDNA引导下结合和切割退火后的单链模板；然后再将孵育温度降低，让切割后的DNA退火形成具有明确黏性末端的双链DNA。小编认为，pfAgo介导的体外切割，从操作上来讲，向导RNA为单链DNA，可直接合成，相比于Cas9系统的向导RNA，ssDNA的获得更为方便且稳定；另外，PfAgo介导的切割或可用于大片段的捕获，将基因组与pfAgo、ssDNA混合，然后根据文章所所报道的步骤进行定点切割，进而捞取我们所想要的大片段。