酵母双杂交系统的研究进展与应用
酵母双杂交系统作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明,酵母双杂交系统既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用, 也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。因此,它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。 1 酵母双杂交系统基本原理 酵母双杂交系统首先是由Fields 和Song 等1 在研究真核基因转录调控中建立的。酵母双杂交系统最初是在人们对酵母转录因子GAL4 的认识基础上的。天然GAL4 分子由1 条多肽链组成,含有881 个氨基酸,1 个完整的酵母转录因子GAL4 可分为结构上可以分开的、功能上相互独立的2 个结构域：位于 N端1 ～ 174 位氨基酸区段的DNA 结合域(DNA binding domain ,DNA - BD) 和位于C 端768～881 位氨基酸区段的转录激活域(Activation domain ,DAN - AD) 。DNA - BD 能够识别位于GAL4 效应基因 (GAL4 - responsive gene) 的上游激活序列(Upstream activating Sequence ,UAS) ,并与之结合。而AD 则是通过同转录机(transcription machinery) 中的其它成分之间的结合作用,以启动UAS 下游的基因进行转录2 。DNA - BD 和AD 单独分别作用并不能激活转录反应,但是当二者在上游较为接近时,则呈现完整的GAL4 转录因子活性并可激活UAS 下游启动子,使启动子下游基因得到转录(图1) 。 图1 酵母双杂交系统基本原理 Fields 等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2 基因有关的2 个蛋白质Snf1 和 Snf2 为模型,将前者与GaL4 的DB 结构域融合,另外一个与Ga14 的AD 结构域的酸性区域融合。由DB 和AD 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵” (bait) 和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein) 。如果在Snf1 和Snf2 之间存在相互作用,那么分别位于这2 个融合蛋白上的DB 和AD 就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因3 (reporter gene) 。通过对报道基因表达产物的检测,反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的 2 个蛋白质之间是否存在相互作用。在此基础上 Fields 等人采用编码β- 半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因,并且在该基因的上游调控区引入受GaL4 蛋白调控的GAL1 序列。这个改造过的LacZ 基因被整合到酵母染色体URA3 位上。而酵母的GAL4 基因和 GAL80 基因(GaL80 是GaL4 的负调控因子) 被缺失,从而排除了细胞内源调控因子的影响。已经知道在 Snf1 和Snf2 之间存在相互作用。结果发现只有同时转化了Snf1 和Snf2 融合表达载体的酵母细胞才有β - 半乳糖苷酶活性,单独转化其中任何一个载体都不能检测出β- 半乳糖苷酶活性。。 2 酵母双杂交系统构成与发展 2. 1 结构组成 酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白---蛋白的相互作用。主要结构由含有DNA 结合域和DNA 转录激活域二类载体以及酵母报告株构成。 将DNA -BD 与已知的诱饵蛋白质X 融合,构建出BD - X质粒载体：将AD 基因与cDNA 文库,基因片段或基因突变体(以Y表示) 融合,构建出AD - Y质粒载体。2 个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。蛋白质X 和Y的相互作用导致了BD 与 AD 在空间上的接近,从而激活UAS 下游启动子调节的酵母菌株特定报告基因(如LacZ , HIS3 ,LEU2 等) 的表达(图1) ,使转化体由于HIS3 或LEU2 表达而可在特定的缺陷培养基上生长,同时因LacZ 表达而在X - Gal 存在下显蓝色(图2) 图2 酵母双杂交系统的实验基本过程 通过筛选阳性菌落即可检测已知蛋白间的相互作用、蛋白质二聚体的形成、确定蛋白质相互作用的结构域或重要活性位点,以及从cDNA 文库中筛选与已知 蛋白质 X 相互作用的未知蛋白质Y的编码序列等。 上述2 类载体在构建融合基因时,测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达,其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4 -BD 具有核定位序列(nUCleat -10calizatiOn sequence) ,而GAL4 - AD 没有。因此,在GAL4 -AD 氨基端或羧基端应克隆来自SV40 的T - 抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding -domain 基因有：GAL4 (1 - 147)：LoxA(Ecoli 转录抑制因子) 的DNA - BD 编码序列。常用的activating - domain 基因有：AL4 (768 - 881) 和疱疹病毒VPl6 的编码序列等。 双杂交系统的另一个构成部分是报道株。报道株指经改造的、含报道基因( repeeter gene) 的重组质粒的酵母细胞。 2. 2 优点 酵母双杂交系统的最重要应用是快速、直接分析已知蛋白质的相互作用及分析新的与已知蛋白质作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白质之间的相互作用具有许多优点4：(1) 检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。 (2) 作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 (3) 检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。 (4) 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建eDNA 文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。 (5) 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型,X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 2. 3 局限性与改进发展 酵母双杂交系统在分析蛋白-蛋白间相互作用具高效和快速性,但在实际应用方面仍存在一些局限性4 - 5 。 (1) 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在细胞核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助,这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。 (2) 酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段,由于仅仅采用β- 半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,而这种报告基因的表达往往不能十分严谨地加以控制, 因此容易产生一些假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用,使DNA 结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种 蛋白质 的低亲和力区域,能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生“假阳性”结果。 许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展5 - 6 ,包括对报道基因、“诱饵”表达载体以及“猎物”表达载体等做了一些改进。其中一个重要改进是引入额外的报道基因,现大多数 酵母双杂交系统 利用酵母营养缺陷特点引入额外的报道基因,如广泛采用的HIS3 基因。经过改造带有HIS3 报道基因的酵母细胞,只有当HIS3 被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。大多数酵母双杂交系统往往同时使用2 个甚至3 个报道基因,用不同的启动子表达位于酵母2 个染色体上的报告基因,可明显减少假阳性。有学者于1996 年构建了PJ69 - 4A 菌株, 内含3 种不同报告基因(AD2、HIS3 和 LacZ) , 分别受3 种不同的启动子( GAL2、GALl 和 GAL7) 调控,而这3 种不同的启动子都由GAL4 激活,该菌株可灵敏地检测出很弱的结合作用,又显著地消除了假阳性现象。 针对某些诱铒蛋白X 或待筛选蛋白Y在酵母中大量表达时,可能对酵母产生一定的毒性作用,近几年来在 酵母双杂交系统 中主要的改进是选用更加灵敏的报告基因从而降低这些异源蛋白在酵母中的表达量,减轻这些异源蛋白在酵母中的毒性,如采用 kexA 酵母双杂交系统。在该系统中GAL4 的BD 区段被原核生物的lexA 蛋白质编码区所取代,单纯疱疹病毒的88 个VP 编码区取代了GAL4 的AD 区段。 由于 酵母双杂交 系统在原核生物细胞进行,未能真正反映高等动物体内蛋白质活动,而近年发展哺乳动物双杂交系统弥补这个缺陷,该系统更好的模仿哺乳动物体内的蛋白---蛋白相互作用,因为哺乳动物双杂交系统有一个更类似于生理环境的蛋白质合成、加工及反应体系,有利于发现起初蛋白质间相互作用,因而,哺乳动物双杂交系统可作为 酵母双杂交 系统的辅助分析手段。 3 基于双杂交原理的其它方法 随着酵母双杂交系统的广泛应用,这一系统得到了不断的完善及改进,同时也衍生出单杂交系统, 三杂交系统等一系列相关的技术。这些技术在不同研究领域中的广泛应用有力地推动了蛋白质与 DNA ,蛋白质与RNA ,以及多种蛋白质分子间相互作用的研究。 3. 1 单杂交系统 酵母单杂交系统最早是1993 年由Li ef al 8 从酵母双杂交系统发展而来,酵母双杂交系统通过对报告基因的表达进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究9 ,而酵母单杂交(yeast one
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