microRNA药物研发的现状与挑战
【慧聪制药工业网】RegulusTherapeutics、MirnaTherapeutics、miRagenTherapeutics三家生物技术公司携手制药界土豪Sanofi、AstraZeneca、Servier引领全球microRNA药物研发，目前已有miR-122、miR-34两个靶点进入临床研究阶段，病毒感染、癌症、心脏病、糖尿病等多个适应症在研。
关于microRNA的基础知识不再赘述，参考本科分子生物学教材。
1.抑制miRNA的方法
(1)miRNA诱骗剂
miRNA诱骗剂（miRNAsponge）是使用一段人造的含多个miRNA结合点的mRNA，诱骗miRNA与之结合从而表达目标mRNA。这种方法在研究miRNA功能的体外实验中有广泛应用，但在体内的应用极其有限，主要通过转基因动物在靶组织中过度表达miRNA诱骗剂。
(2)反义核酸
针对RNA靶点最常用的手段就是反义核酸，反义核酸通过与miRNA高度互补，可以组断miRNA与目标mRNA结合。反义核酸是很难直接用于体内的，它们很难直接穿透细胞膜，需要经过化学修饰改善PD/PK。
(3)小分子抑制剂
miRNA涉及多个生物化学步骤，可以筛选小分子抑制剂，干扰miRNA的表达和功能的实现。比如有文献[1,2]报道了抑制miR-21和miR-122的小分子，但EC50在微摩尔级，而且缺乏直接靶点的信息，因此应用潜力仍然非常有限。
2.反义核酸的化学修饰
(1)2ʹ-O-甲基化
将核苷酸2’-位的羟基甲基化是一种常见方法，可以提高寡核酸对核酸酶的耐受性。2004年的两篇篇论文中[3,4]，作者分别用一段31个核苷酸、24个核苷酸长度的甲基化RNA抑制miRNA和siRNA的功能。尽管甲基化修饰提高了寡核酸的稳定性，但仍然不能避免被血清中的核酸外切酶降解，因此不适用于体内。
(2)硫代磷酸
由于核酸外切酶切割的是两个核苷酸之间的磷酯键，因此将磷酸基团上的一个氧原子替换为硫便能提高稳定性。硫代磷酸修饰的寡核酸增强了与血浆蛋白、细胞表面的亲和力，能够在1-2个小时内从注射部位吸收进入血液，而且能够被肝、肾、脾、淋巴结、脂肪组织、骨髓摄取。但这种修饰会降低对miRNA的亲和力，全硫代磷酸修饰的反义核酸完全没有miRNA抑制活性，因此只能选择性替换部分磷酯键。
(3)2ʹ-O-MOE修饰
2’-位甲氧基乙基化在对miRNA的亲和力和对核酸酶的耐受性上都优于2’-位甲基化，2008年的一篇论文中[5]，作者用2ʹ-O-MOE修饰的寡核酸抑制了miR-143，从而增加了目标基因的表达，这证明了2ʹ-O-MOE修饰相对于2ʹ-O-甲基化的优势。
(4)2ʹ-F修饰
将核苷酸2’-位的羟基替换为氟，可以将糖环锁定为3ʹ-endo构象，产生优越的亲和力，每个核苷酸片段大约增加Tm值2-3oC。但单纯的2ʹ-F修饰是不耐受核酸酶的，必须用硫代磷酸连接才能在血清中实现较好的稳定性。
(5)锁核酸
锁核酸是将2’-位的氧与4’-位的碳通过亚甲基连接起来，形成双环核苷酸，同时将糖环锁定为3ʹ-endo构象。这种修饰既能增加对核酸酶的耐受性，又能大幅增加对miRNA的亲和力，每个锁核酸片段大约增加Tm值4-6oC。锁核酸性能优越，5nM剂量下即可抑制miRNA，联合其他方法如2ʹ-F修饰，有效性可进一步增强。
3.体内给药策略
(1)缀合物
虽然化学修饰一定程度上改善了反义核酸的亲和力和稳定性，但缺乏载体的情况下组织分布有限，容易被肝肾摄取，很快经尿液排出体外。体内给药的一种策略是缀合物修饰，比如在3’-端接上胆固醇，这样就能混进高密度脂蛋白中，输送到肝、肾、肠及类固醇器官。
另一种方法是在5’-端接上维生素E，这可以有效地将siRNA输送到肝脏[6]，从而敲除ApoB的表达，小鼠只需要给药2mg/kg，而如果缀合胆固醇，需要的剂量高达50mg/kg。最近文献报道siRNA缀合SPACE肽[8]，有助于穿透角质层，因此通过皮肤给药也有可能。
TLR9(Toll-likereceptor9)是CpGDNA的内源受体，因此可以缀合CpGDNA，从而靶向表达TLR9的细胞，这被用于沉默TLR9+骨髓细胞、B细胞中的转录因子STAT3[7]，从而增强抗肿瘤免疫应答。
(2)脂质体
2005年Morrissey报道了应用脂质体输送siRNA的方法[9]，将siRNA用PEG脂质体包裹起来，用于阻断小鼠体内HBV的复制，剂量为3mg/kg，远远低于裸露的siRNA，随后脂质体在核酸的给药中得到广泛研究。
特别值得一提的是GalNAc-PEG脂质体[10]，通过N-乙酰半乳糖（GalNAc）与细胞表面的半乳糖特异性受体ASGPR结合，可以实现肝靶向，有效剂量甚至可以是0.02mg/kg。还有一种是在脂质体中引入透明质酸和整合素抗体[11]，这样可以将siRNA靶向白细胞，沉默cyclinD1的表达。
(3)纳米粒
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