PLoS ONE：新技术酶法大规模制造高纯度硫代修饰寡核苷酸分子

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

2013年7月5日电 /生物谷BIOON/ -- 最新一期PLoS ONE（7月4日）报道了一种制造硫代修饰寡核苷酸分子的新方法，用于生产成分高纯度的寡核苷酸类基因药物。这项技术由中国海洋大学生命科学学院的研究人员完成，该成果将有助于推动寡核苷酸药物的发展。

目前，寡核苷酸主要采用化学方法合成，但化学合成寡核苷酸涉及多步骤的反应，容易出现错误，产物纯度较低，且纯化十分困难。大规模合成寡核苷酸的成本十分高昂，大大限制了寡核苷酸药物的研究和应用。文章的通讯作者，中国海洋大学的汪小龙副教授解释道：“我们首创了一种新的基于热循环的寡核苷酸扩增方法，称为“聚合酶-内切酶扩增反应”（Polymerase-endonuclease amplification reaction, PEAR），该方法采用酶催化法使寡核苷酸分子数目指数增加，实现寡核苷酸的自我复制，大大提高寡核苷酸产品的纯度。”

该论文的另一作者陈刚博士说：“这种新的寡核苷酸生产方法具有很多优点，能解决目前寡核苷酸制造中的诸多问题。PEAR产物无需经过任何处理，无需加入新的引物和模板，直接作为‘种子’进行二次扩增，使寡核苷酸等小分子核酸能够像病毒一样自我复制。相对化学法该技术不需要昂贵的设备，大大降低了生产成本，而且很容易将工艺放大，能够用于大规模生产修饰寡核苷酸。”

PEAR反应独特的“滑动-切割反应机理”，由耐热DNA聚合酶和耐热限制性内切酶协同作用，使得只有目标序列寡核苷酸能够指数扩增，而非目标序列由于缺少重复序列和酶切位点，无法被扩增。目前该研究小组已成功用PEAR方法制备出了带有硫代、氟代和甲基修饰基团的寡核苷酸，经变性高效液相色谱和电喷雾质谱检测（LC/MS），证实其分子结构和序列无误。与化学合成法相比，PEAR产物几乎没有错误序列，因此PEAR产物纯度极高，产物中目标寡核苷酸序列含量所占比例超过99.9%。

该研究由国家自然科学基金项目“聚合酶-内切酶扩增反应制备反义寡核苷酸（81072567）”资助。该课题评审和立项专家意见认为：“PEAR技术在大规模制备寡核苷酸药物中具有良好的应用前景”。目前该方法已经申请了国际发明专利（PCT/CN2009/000362）。（生物谷Bioon.com）

相关背景：寡核苷酸是生命科学等领域研究的一种基本工具，近期生物医药研究和发展中取得了一些重大突破，寡核苷酸药物市场前景十分看好。反义寡核苷酸已经被开发为基因靶向治疗的药物，用于抗病毒、抗肿瘤和治疗遗传性疾病。CpG寡核苷酸则能够激活非特异性免疫反应，可用作免疫增强剂和疫苗佐剂。2013年1月，美国ISIS公司和Genzyme公司合作的一大成果反义寡核苷酸药物KYNAMRO（Mipomersen）通过美国FDA认证，目前已经上市。Mipomersen是化学合成的辅助降脂药物，通过反义寡核苷酸抑制载脂蛋白 B-100的mRNA，用于治疗家族性高胆固醇血症（HoFH）。

现代分子生物学实验室中，普遍用寡核苷酸作为引物，采用聚合酶链式反应（PCR）扩增核酸分子，但PCR不能直接扩增寡核苷酸。因为它们往往只有18-30个核苷酸的长度，无法设计一对特异性PCR引物。用PCR来扩增寡核苷酸，必须首先设法（如加接头或使用通用引物）将目标延长。另外，PCR只是将寡核苷酸引物延伸，PCR扩增产物DNA的分子数不可避免地受输入寡核苷酸引物浓度的限制，二次扩增必须加入新的寡核苷酸引物，因此PCR技术不适合于大规模制备寡核苷酸。

目前国际上已经出现了一些新型核酸扩增方法，但能够用于扩增寡核苷酸的方法极少。2003年PNAS杂志报道了指数扩增反应（EXPAR）。2013年6月2日Nature Methods杂志报道利用滚环复制或者细菌体内复制DNA序列的过程，能以较低的成本、按特定比例制造大量的DNA分子。但这些方法目前尚不能产生带有硫代修饰的寡核苷酸。由于天然的寡核苷酸在体内很容易降解，而且具有一些毒副作用，因此作为药物的寡核苷酸必须在磷酸二酯键中带有硫代修饰基团，增强寡核苷酸在体内的稳定性。

生物谷推荐英文摘要1：

PLoS One doi:10.1371/journal.pone.0067558.

Preparation of 5′-O-(1-Thiotriphosphate)-Modified Oligonucleotides Using Polymerase-Endonuclease Amplification Reaction (PEAR)

Antisense oligonucleotides (ASODNs) have been widely used as an important tool for regulating gene expression, and developed into therapeutics. Natural ODNs are susceptible to nuclease degradation, nucleic acid analogues, however, have less side effects, stronger stability and more potent activities. Large-scale de novo synthesis of a certain oligonucleotide has been very difficult and costly. In a previous preliminary study, we developed the polymerase-endonuclease amplification reaction (PEAR) for amplification and large-scale preparation of natural antisense ODNs. Here we extended the method in preparation of a widely used modified oligonucleotide with 5′-O-(1-Thiotriphosphate) modifications. Using electrospray ionization liquid chromatography mass spectrometry (ESI/LC/MS) detection, the purity of the PEAR product was measured as high as 100.0%. Using PEAR a large amount of a specific oligonucleotide can be produced starting from a small amount of synthetic seeds. It is suggested that PEAR can be a useful tool for large-scale production of modified oligonucleotides.

生物谷推荐英文摘要2：

PLoS ONE doi:10.1371/journal.pone.0008430.

Polymerase- Endonuclease Amplification Reaction (PEAR) for Large-Scale Enzymatic Production of Antisense Oligonucleotides.