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作者：张馨予

什么是细胞传代？

细胞传代培养（subculture），当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。

将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养的过程被称之为细胞传代培养。对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。

耗材准备

在实验开始前，需要把实验用品准备齐全。

酒精、预热好的完全培养基、PBS缓冲液、胰酶、培养瓶或培养皿、移液器、移液管、离心管等

实验用的超净工作台需提前半小时照射紫外线。

实验操作

以贴壁细胞培养为例

1、穿好细胞房专用的实验服，戴好灭菌手套和口罩。

2、从培养箱中取出细胞培养瓶或培养皿（Tip1：一般选择处于对数期的细胞），用75%酒精消毒外包装后转移至到超净台中。

3、打开盖子（Tip2：如果是培养皿，只需打开一个缝隙即可，避免污染），轻轻吸出旧的培养液，加入适量PBS缓冲液洗涤1-2次（Tip3：注意从未培养细胞的侧壁加入，以免冲掉细胞），弃去PBS缓冲液。

4、用移液器加入适量胰酶（Tip4：具体量根据实验需要确定，提前将胰酶37℃预热，效果更好），盖好盖子，“十字”晃动，使胰酶充分接触细胞。

5、将加入胰酶的细胞培养瓶转移到倒置显微镜载物台，镜下观察细胞消化情况，当细胞变圆且大量脱落时，准备终止消化（Tip5：若初始的细胞密度比较高，加入胰酶后，肉眼也可观察到细胞脱落，当细胞有一半左右脱落时，即可终止消化，避免反复将培养皿拿出超净台，避免增加污染的风险），用75%的酒精喷洒培养瓶表面，转移到超净台。

6、用移液器加入等量含血清培养基，终止消化。移液器充分且柔和地吹打，避免产生气泡，使细胞完全脱落。

7、将培养瓶或培养皿中混合液体转移至离心管中（离心管规格根据实验需要确定），配平后离心3-5分钟左右（离心机转速根据细胞种类而定，常见的有1000-3000rpm/min）。

8、离心好后，用酒精喷壶喷洒离心管表面，转移进超净台，打开盖子，将上清液倒入废液缸。

9、加入适量体积含血清培养基，用移液器或巴氏吸管轻轻吹打，制成细胞悬液。

10、将细胞悬液分装进2个（或多个）洁净灭菌培养瓶或培养皿中，加入适量培养基，盖好盖子。

11、将分装好的培养瓶置于倒置显微镜载物台，观察细胞情况，细胞应保证一定数量，数量太少会影响生长情况。

12、在培养瓶上做标记，注明传代时间，细胞种类，操作人员等信息。在放入培养箱之前应再次用酒精喷一喷培养瓶表面，然后应记得整理操作台，用75%酒精擦拭超净台台面，清理废液和垃圾。

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