CRISPR诞生十周年，Jennifer Doudna解读未来的4个发展

作者：张馨予

2012年6月28日，Jennifer Doudna、Emmanuelle Charpentier在国际顶尖学术期刊 Science 上发表了题为：A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity 的研究论文【1】。

揭示了 CRISPR/Cas9 的详细作用机制，宣告了一种全新的基因编辑技术的诞生。通过人工设计 crRNA 和 tracrRNA 这两种 RNA ，就可以改造形成具有引导作用的 sgRNA （single guide RNA ），从而引导 Cas9 对 DNA 进行定点切割，为完成特定的基因编辑做准备。此后10年里，CRISPR/Cas9 一枝独秀，成为公认的最简单高效的基因编辑方式，大大加速了生命科学的研发进程。 波澜壮阔的发展史CRISPR/Cas9 系统是古细菌和细菌不断进化而来的免疫防御机制。早在1987年，Nakata 课题组就偶然发现，在大肠杆菌基因组上存在着含有29个碱基的高度同源重复性序列，且这些重复序列间存在着含有32个碱基的间隔序列。

21世纪初，西班牙科学家 Francisco Mojica正式将这种具有规律性的重复序列命名为 CRISPR（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats），即一种成簇规律间隔的短回文序列，并且在重复序列附近发现了一系列保守的 CRISPR 相关基因（Cas）。

此后，一个新术语开始进入了人们的视野。CRISPR 吸引了全球各地的科学家参与研究，其中就包括Emmanuelle Charpentier教授和Jennifer A. Doudna教授。 2011年，Emmanuelle Charpentier 教授在链球菌中发现，若想要让 CRISPR 系统起作用，不仅需要 CRISPR 序列和 Cas 蛋白，还需要另外一种叫做 tracrRNA 的全新 RNA 分子给予配合。同年3月，一场学术会议让 Emmanuelle Charpentier 教授与 Jennifer A. Doudna 教授不期而遇。Jennifer A. Doudna教授在 RNA 研究上卓有建树，且对 CRISPR 机制研究亦有所涉略。两位学者有着很多共同点：她们的团队都在研究细菌防御病毒入侵的机制；二人实验室的研究生 Krzysztof Chylinski 和 Martin Jinek 在毗邻的城镇长大，说着同样的波兰方言…… 命运就是这样充满巧合，二人间天衣无缝的合作或许冥冥之中早已注定。 Emmanuelle Charpentier 教授当即向 Jennifer A. Doudna 教授发出合作邀请，两人一拍即合，携手开启了 CRISPR 机制的发现之路。仅仅一年后，她们便阐明了 CRISPR 复杂系统中各个不同组成部分所扮演的角色，并在试管中重现了这一系统在细菌体内能做的事——对目标 DNA 进行剪切。更为重要的是，她们发现这一系统经过改造后可以在指定位点切开任何 DNA 分子，这为后续的基因编辑提供了无限可能。与早期的 ZFN 和 TALEN 技术相比，新问世的 CRISPR/Cas9 技术更为简单高效，能在模型构建和疾病治疗等领域发挥重要的作用，属于 CRISPR 的时代正式到来：

2013年，哈佛大学医学院的 George Church、麻省理工学院博德研究所的张锋以及加州大学旧金山分校系统及合成生物学中心的亓磊，将 CRISPR/Cas 系统成功应用于哺乳动物细胞基因编辑。

2013年12月，Science 认定 CRISPR 基因编辑技术为当年的十大科学突破；

2015年12月，Nature 将 CRISPR 基因编辑技术评为“十大科学事件之一”；

2019年10月，刘如谦团队公布了一种先导编辑（Prime editing）技术，通过一系列 ABE 蛋白突变体，最大限度地减少了 CRISPR 基因编辑技术的脱靶效应，迈出了其临床应用的又一大步！

2020年10月，开发CRISPR基因编辑技术的两位科学家Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer A. Doudna 荣获诺贝尔化学奖。

CRISPR诞生十周年，Jennifer Doudna解读未来的4个发展

图2：来源诺贝尔奖官网

诺贝尔奖委员会在新闻稿中盛赞道，这是“划纪元”的发现！

奋勇正当时

在问世后的10年里，CRISPR 技术的发展和应用势如破竹，在基因敲除、基因敲入、基因抑制和激活、多重编辑、功能基因组筛选等领域中大放异彩，为保卫人类的健康与福祉做出巨大的贡献，并创造出许多喜人的临床进展： 2014年6月，麻省理工学院的研究人员通过从尾部直接注射 CRISPR 的方式，治愈了患酪氨酸血症（tyrosinemia，一种的罕见肝脏疾病）的成年小鼠。 2019年11月，美国公布了首个 CRISPR 疗法临床试验阳性数据，CRISPR Therapeutics和 Vertex Pharmaceuticals 的 CRISPR/Cas9 基因编辑疗法 CTX001，在1/2期临床试验中取得了积极的中期疗效数据。一名输血依赖性β地中海贫血症（TDT）患者和一名严重镰状细胞贫血症（SCD）患者在接受 CTX001 治疗后，均达到了停止输血依赖的效果，这可谓是生命的奇迹！ 2020年，一位有失明风险的遗传病患者成为了全球首位直接接受 CRISPR–Cas9 体内基因治疗的人。波特兰俄勒冈健康与科学大学的医生向病人的视网膜中注射了一种被编码在病毒载体中的基因药物，以治疗 Leber 先天性黑内障病（LCA10）。 2021年12月3日，英国弗朗西斯·克里克研究所 Charlotte Douglas 等人以小鼠为模型，开发了一种合成的致死性双重 CRISPR/Cas9 策略，可以以 100% 的效率生产仅雄性或雌性的小鼠窝。即使用这种方法，研究人员能够100%有效地控制幼崽的性别。为了产下一窝雄性幼崽，研究人员编辑了父亲的X染色体，这意味着只有雌性继承了有害的突变，而对于一窝雌性幼崽，他们编辑了Y染色体。 2022年6月17日，美国格拉斯通研究所和斯坦福大学的研究人员通过 CRISPR 筛选揭开了 T 细胞耗竭的秘密。研究团队采用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术来依次改变细胞中的数万个基因，以此分析T细胞在其T细胞受体持续激活后表现出的耗竭水平。这让研究人员能够确定哪些基因在触发T细胞耗竭中发挥重要作用。除了医学领域的应用外，基础生物学家们也使用 CRISPR 技术来研究各个基因的功能；植物学家们则用 CRISPR 技术来改造作物，提高其对疾病的耐受能力；动物学家使用 CRISPR 技术更精确地培育具有高产量、高抗病性、更佳的营养比例和其他有益特性的牲畜品种。 CRISPR 技术是一把当之无愧的基因 “魔剪”，正在助力科学家们修改生命的蓝图！

未来的四个发展方向