T病毒包装质粒生产纯化及质量控制
经验分享：CAR-T病毒包装质粒生产纯化及质量控制
2021-12-26 01:00 来源: 基因狐
原标题：经验分享：CAR-T病毒包装质粒生产纯化及质量控制
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric AntigenReceptor T-Cell Immunotherapy，简称CAR-T），是一种新型精准靶向，有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法，近几年在临床肿瘤治疗上取得很好的治疗效果。它是通过基因工程技术，把T细胞“组装”上能定位导航的肿瘤嵌合抗原受体（CAR），能专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的效应因子，能高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。
2017年8月FDA批准了全球首个CAR-T细胞治疗产品上市（商品名：Kymriah），用于治疗复发或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病及弥漫性大B细胞淋巴瘤患者。同年10月FDA批准了第二款CAR-T产品上市（商品名：Yescarta），主要用于治疗复发或难治性B细胞急性淋巴细胞白血病的治疗。这两款CAR-T的上市极大地鼓舞了细胞免疫治疗研发热情，CAR-T疗法在某些血液肿瘤中具有显著的疗效，并预示着肿瘤治疗模式的变革。全球首个接受CAR-T治疗的白血病女孩Emily，在5岁时被诊断患有急性淋巴细胞白血病（ALL），6岁Emily两次白血病复发而生命垂危，2012年她参加了CAR-T临床试验，现在她癌细胞完全消失，过着健康的生活。
CAR分子结构及发展史CAR分子是一种由抗体衍生的片段组成的可识别结合肿瘤并促进T细胞扩增的共刺激分子偶联肿瘤嵌合抗原受体，它包含一个胞外配体结合区（scFV）、一个跨膜区和一个胞内信号区。胞外配体结合区能特异性靶向肿瘤表面的特定抗原，胞内的信号区有驱动CAR-T细胞效应子的功能，共刺激信号结构域可以使T细胞持久活化。
第一代青铜段位：针对的是肿瘤的CD19或CD20抗原，信号转导区由胞内的CD3ζ链组成。第一代CAR-T细胞在体内生存能力不强，也不能产生足够的IL-2，仅具有限的抗肿瘤作用。
第二代白银段位：信号转导区加了一个共刺激信号分子（如CD28、4-1BB）。与第一代相比，第二代CAR-T产生的IL-2得到大幅度加强，杀伤肿瘤的能力得到了提升，但是疗效不够持久。
第三代黄金段位：加了两个共刺激信号分子（CD28、4-1BB或CD134），提高了CAR-T的增殖能力和杀伤性。
第四代白金段位：在第三代CAR-T的基础上又加了细胞因子或共刺激配体（如IL-12/IL15/anti-PD-1等），可以通过局部释放细胞因子来调节微环境并招募免疫效应细胞杀伤肿瘤，在微环境的免疫抑制和实体瘤方面发挥一定的促杀伤作用。第四代CAR-T细胞的扩增能力更强，在体内停留的时间也更久。
第五代砖石段位——通用CAR：由于目前大部分CAR-T细胞都是利用患者自身的T细胞来产生的，而患者与患者之间存在个体差异，制备T细胞是一个昂贵且耗时的过程。除此之外，每种CAR具有固定的抗原特异性仅能靶向特定的肿瘤表位，因此科学家们致力于开发一种通用型CAR-T细胞，生产一种现成的（off-the-shelf）即用型治疗剂。
通用CAR-T是使用ZFNs，TALENs以及CRISPR/Cas9等基因编辑工具，敲除异体T细胞上的TCR、MHC以及相关信号通路基因，从而防止异体型CAR-T的宿主排斥反应。此外敲除PD-1与CTLA4等T细胞抑制信号分子，能够进一步增强CAR-T细胞的功能。通用CAR-T并不依赖于病人的淋巴细胞，是非定制的细胞疗法，能够现货供应为更多的病人提供治疗。
CAR-T疗法的流程利用白细胞分离术收集患者的T细胞，然后在体外进行T细胞活化，通过装备CAR基因的慢病毒载体，将CAR基因转入T细胞从而CAR-T细胞，CAR-T细胞经扩增纯化然后回输患者体内进行治疗。具体过程如下：
慢病毒载体是由三个包装质粒和一个表达质粒（也称穿梭质粒）瞬间共转染293T细胞，通过克隆筛选获得稳定组装表达高滴度慢病毒载体的细胞株，经发酵纯化后获得一定质量要求的慢病毒。
慢病毒载体包装四质粒系统质粒系统
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