一种杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

作者：杨超月

1.本发明涉及一种杂交瘤细胞株及其应用，属于生物医学领域。

背景技术：

2.血栓性疾病是一种起病隐匿、发病突然、致死致残率较高的疾病，可见于几乎各个临床科室，其病理过程涉及血管内皮、凝血和纤溶三大系统。现有的研究已经证实血栓前状态时，血管内皮、凝血和纤溶系统已发生改变，tat、pic、tpai-c和t-pai-c是有效反应机体血管内皮、凝血和纤溶系统早期改变的有效指标，适用于各临床学科血栓高位人群血栓早期诊断及血栓风险评估。
3.组织型纤溶酶原激活剂及其抑制剂-1复合物(tpai-c)是血管内皮细胞释放到血液中的组织型纤溶酶原激活物(t-pa)与生理性抑制因子纤溶酶原激活物抑制物(pai-1)以1：1结合而形成的复合物。tpai-c是纤溶系统分子标志物，也是血管内皮细胞受损的分子标志物。
4.研究表明，tpai-c是静脉血栓栓塞(vte)的最佳诊断标志物之一，在vte患者血浆中活化的pai-1和tpai-c水平比健康对照人群明显升高，当tpai-c的cutoff取为3.6ng/ml时，其诊断vte的灵敏度为74％(95％ci 64～82％)，特异度为69％(95％ci,59～77％),roc曲线下面积为0.75(95％ci，0.68～0.72)。
5.同时tpai-c也可作为心肌梗死(mi)的风险预测指标。无论是男性或女性，血浆中tpai-c浓度与mi风险呈显著相关，男性和女性的风险比值比(or)分别为2.4和2.0。在男性患者中，吸烟或糖尿病与血浆tpai-c具有协同作用。风险比值比(or)分别为4.6和7.9。
6.tpai-c作为tpa和pai-1的复合物，其检测容易受tpa和pai-1单体的干扰。因此若要通过免疫学对其准确定量，则需要特定表位的单克隆抗体。

技术实现要素：

7.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能分泌tpai-c(组织型纤溶酶原激活剂及其抑制剂-1复合物)单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由本发明杂交瘤细胞株分泌的tpai-c单克隆抗体可准确测定tpai-c。
8.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
9.第一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为t-paic2#，已于2020年4月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c202066，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
10.第二方面，本发明提供了一种tpai-c单克隆抗体，所述tpai-c单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株分泌产生。
11.第三方面，本发明提供了上述tpai-c单克隆抗体在制备检测tpai-c或静脉血栓栓塞的试剂盒中的应用。
12.第四方面，本发明提供了上述tpai-c单克隆抗体在制备预测心肌梗死风险的试剂
盒中的应用。
13.第五方面，本发明提供了一种用于检测tpai-c或静脉血栓栓塞或预测心肌梗死风险的试剂盒，所述试剂盒包含上述tpai-c单克隆抗体。
14.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包含磁微粒、抗tpai-c抗体、ap、戊二醛和牛血清白蛋白。
15.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒用于化学发光法检测。
16.第六方面，本发明提供了一种编码上述tpai-c单克隆抗体的多核苷酸。
17.第七方面，本发明提供了一种载体，其包含上述多核苷酸。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种新的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株可分泌对tpai-c蛋白不同表位具有高亲和力的单克隆抗体。采用本发明的单克隆抗体检测tpai-c，不容易收到tpa和pai-1单体的干扰，准确度高。
19.本发明的tpai-c单克隆抗体可用作体外诊断试剂，例如用于制备化学发光检测试剂盒，准确定量血液中tpai-c蛋白的浓度，其具有巨大的经济和社会效益，为精确诊断、对症用药等临床治疗提供重要的辅助检测手段。
附图说明
20.图1为本发明制备tpai-c复合物时的sds-page结果图；
21.图2为本发明采用tpai-c复合物免疫小鼠后，尾血效价检测结果图；
22.图3为本发明采用间接elisa法测定抗体效价的结果图；
23.图4为本发明采用tpai-c单克隆抗体检测tpai-c的标准曲线图；
24.图5为采用希森美康化学发光试剂检测tpai-c的标准曲线图。
具体实施方式
25.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
26.tpai-c作为tpa和pai-1的复合物，其检测容易受tpa和pai-1单体的干扰。若要通过免疫学对其准确定量，则需要特定表位的单克隆抗体。为此，本发明采取了下述技术方案：
27.第一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为t-paic2#，已于2020年4月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c202066，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
28.本发明的杂交瘤细胞株是采用下述方法获得：以tpai-c作为抗原免疫小鼠，将免疫效价符合要求的小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，得到所述杂交瘤细胞株。
29.由本发明杂交瘤细胞株分泌的tpai-c单克隆抗体对tpai-c蛋白不同表位具有高亲和力，采用它来检测tpai-c，准确度高。由此，tpai-c单克隆抗体可用作诊断试剂(例如体外诊断试剂)检测tpai-c，根据tpai-c的检测结果也可判断待测者是否患有静脉血栓栓塞或者预测心肌梗死风险。
30.第二方面，本发明提供了一种tpai-c单克隆抗体，所述tpai-c单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株分泌产生。
31.第三方面，本发明提供了上述tpai-c单克隆抗体在制备检测tpai-c或静脉血栓栓塞的试剂盒中的应用。
32.第四方面，本发明提供了上述tpai-c单克隆抗体在制备预测心肌梗死风险的试剂盒中的应用。
33.第五方面，本发明提供了一种用于检测tpai-c或静脉血栓栓塞或预测心肌梗死风险的试剂盒，所述试剂盒包含上述tpai-c单克隆抗体。
34.本发明的tpai-c单克隆抗体对tpai-c蛋白不同表位具有高亲和力，可利于这二者的亲和作用，对tpai-c蛋白进行免疫分析。
35.作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包含磁微粒、抗tpai-c抗体、ap、戊二醛和牛血清白蛋白。其中，抗tpai-c抗体与tpai-c蛋白在tpai-c单克隆抗体上的识别位点不相同。该试剂盒的使用方法为：(1)将tpai-c单克隆抗体通过n末端氨基与磁微粒(mps)共价偶联；(2)将识别另一个位点的抗tpai-c抗体、ap和与戊二醛偶联；(3)应用步骤(1)和步骤(2)所得偶联物、在夹心反应模式下检测tpai-c。
36.化学发光法进行检测灵敏度高、检测快，所述试剂盒可用于化学发光法检测。当然，采用tpai-c单克隆抗体检测tpai-c的方法并不限于化学发光法，也可采用其他方法，例如显色法等。本领域技术人员可根据常规选择采用何种方法进行测定。
37.第六方面，本发明提供了一种编码上述tpai-c单克隆抗体的多核苷酸。
38.第七方面，本发明提供了一种载体，其包含上述多核苷酸。
39.实施例
40.本实施例制备了tpai-c单克隆抗体，并以tpai-c单克隆抗体为检测试剂，采用化学发光法检测tpai-c。具体步骤如下：
41.一、tpai-c单克隆抗体的制备
42.1、抗原制备(tpai-c复合物的制备)
43.tpai-c复合物采取以下方式进行制备。将pai-1用4m盐酸胍于ph5.5下充分活化后，与tpa按摩尔比2:1在中性环境下充分混合后，后置于37℃孵育1h，使其充分复合。后以纤维蛋白为配体的琼脂糖凝胶柱进行分离纯化，分离纯化的sds-page结果如图1所示。获得成纯度大于90％复合物。
44.2、动物免疫方法及步骤
45.选取5～6周雌性balb/c小鼠6只，以tpai-c复合物完成首次免疫后，分两组，每组3只，分别以tpa和pai-1进行两次加强，免疫流程见表1。于第三次免疫后的第七天，取尾血进行血清效价检测，结果见图2。选取效价最高的小鼠，进行冲击融合。
46.表1：蛋白免疫信息汇总
[0047][0048]
3、脾细胞与骨髓瘤细胞的融合
[0049]
融合前一周，采用常规的细胞复苏方法，复苏冻存的骨髓瘤细胞(sp2/0)细胞，然后挑选状态好的sp2/0细胞，融合前一天换液。取免疫效价符合要求的小鼠的脾脏细胞，置于无菌筛网上。用注射器芯研磨脾脏，边研磨边滴加1640不完全培养基。研磨至只剩白色的脾脏膜。收集脾细胞至50ml离心管，1200rpm离心5min，弃上清，收集，重悬。sp2/0与脾细胞离心后分别用10ml不完全培养基重悬，稀释计数。最适宜比为1：1到1：4，按比例将两种细胞混合。离心1200rpm 5min，弃上清。用ecf buffer重悬混匀，再1200r/min低速离心5min，去上清。重复ecf buffer洗涤一遍。最后用6.4ml ecf buffer重悬，备用。接通电融合仪电源，按“ω”键，测电阻，电阻值应大于2kω。加入6.4ml ecf buffer重悬的细胞混合液。注意应缓慢滴加，以免产生气泡影响电阻。按“ω”键，确认电阻值在0.8k～2kω之间。无误后再按“start”键，等待电融合提示完成。电击结束后将细胞混合液转移至12.8ml修复液中，修复破坏细胞膜。37℃(培养箱)静置10min。注意转移时吸头须伸到液面以下，再缓慢打出，800rpm离心5min。弃上清。用完全培养基(含20％胎牛血清、1％hat和适宜比例饲养细胞)重悬细胞，转移至96孔板，于37℃细胞培养箱中进行培养。
[0050]
4、间接elisa检测
[0051]
采用免疫鼠对应免疫抗原用包被液稀释，加入96孔酶标板，每孔加入100μl，4℃包被过夜，pbst洗涤孔板1次；然后用3％吐温pbs封闭4℃包被过夜；pbst洗涤孔板1次后。将每只免疫小鼠的血清(或是融合培养后待检测的细胞上清及筛选的阳性克隆细胞)分别稀释103、104、105、106倍，加入反应孔中，以未免疫的小鼠血清作为阴性对照，放入37℃恒温箱内反应1h，采用辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠作为二抗进行检测，加入tmb显色底物反应后，酶标仪读取各反应孔od450。
[0052]
5、抗体表位分析
[0053]
以tpai-c、tpa和pai-1分别包被酶标板，检测三种免疫原所获得单克隆抗体，并根据检测结果，将抗体分为三组：组1表位位于tpai-c上，命名为tpai-c，组2表位位于tpa单体上，命名为tpa，组三表位位于pai-1单体上，命名为pai。
[0054]
6、抗体亚类的鉴定
[0055]
取细胞培养上清，按照sigma公司的单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对制备的单克隆抗体进行亚类分析。
[0056]
抗体信息及表征汇总结果如表2所示。
[0057]
表2抗体信息及表征汇总
[0058][0059][0060]
7、单克隆抗体的制备
[0061]
挑选于tpai-c反应的细胞株，亚克隆至定株后，以5*10^5/只小鼠的密度注射到小鼠腹腔，于7～14天采集腹水，以protein a进行亲和纯化，微量分光光度计测定蛋度，sds-page测定抗体纯度。
[0062]
8、抗体的效价测定
[0063]
间接elisa法进行测定，将纯化后的抗体以pbs调整至1ug/ml，分别用1％吐温pbst稀释到103、104、105、106倍。在elisa检测仪上，于450nm(若以abts显色，则410nm)处，以阴性对照孔调零后测各孔值，若od大于规定的阴性对照od值的2.1倍，即为阳性。见图3(以最终挑选的tpai-c 1#和tpai-c2#为例)。
[0064]
二、化学发光tpai-c检测试剂的建立
[0065]
1、tpai-c抗体包被mps
[0066]
高亲和力tpai-c单克隆抗体通过n末端氨基与磁微粒(mps)共价偶联。首先，将20mg/ml的mps置于2.0ml ep管中。用结合缓冲液洗涤mps五次。在洗涤过程中，将管置于磁力浓缩器上并除去上清液。然后，将mps重悬于2ml结合缓冲液中。在37℃下振荡培养过夜，将抗体溶液加入到上述悬浮液中。孵育后，将ep管置于磁力浓缩器中以将它们与上清液分离。用3％牛血清白蛋白(bsa)封闭mps上的残留结合位点，在37℃温育并轻微摇动2小时。洗涤5次后，将包被的免疫磁珠(mab-mps)分散在2ml缓冲液中并在4℃下保存，备用。
[0067]
2、ap标记tpai-c抗体的制备
[0068]
识别另一个位点的抗tpai-c抗体、碱性磷酸酶(ap)和与戊二醛偶联。首先，将ap和
抗tpai-c抗体悬浮在超纯水中并分别稀释至4和8mg/ml。将250μl等份的4mg/ml ap溶液转移至1.5ml ep管中并与250μl 8mg/ml抗tpai-c抗体溶液混合。其次，向溶液中加入0.5ml含1％戊二醛的0.1mol l-1磷酸盐缓冲液(ph7.4)。将所得混合物在37℃下在黑暗中轻微振荡温育4小时。第三步，向混合物中加入0.1ml 1mol/l单乙醇胺溶液，随后在室温下振荡温育2小时。将混合物在4℃下用pbs溶液透析过夜。透析后，将酶标tpai-c抗体转移至ep管中，并与等体积的甘油和1％bsa混合。最后，将酶标tpai-c抗体(ap-mabs)储存在-20℃，备用。
[0069]
3、基于mps的全自动化学发光法检测tpai-c
[0070]
应用磁珠包被抗体(mab-mps)和酶标抗体(ap-mabs)夹心反应模式在全自动化学发光仪上进行tpai-c检测。首先，将50μl不同浓度的mab-mp和cpp样品或者标准品(30μl)分别移液到与仪器匹配的管中，并在37℃轻轻摇动孵育20分钟(捕获时间)。然后管子通过清洗站用洗涤液(含有0.05％twe的0.01mol l-1pbs)洗涤3次，去除非特异性的结合。然后加入ap-mabs，37℃轻轻摇动孵育10分钟。此时，夹心免疫复合物mps-tpai-c-ap形成。将形成的夹心免疫复合物磁分离，并通过洗涤除去过量的ap-mabs。随后，将含有发光底物amppd(200μl)的溶液加入夹心复合物。将所得混合物在免疫测定仪器中温育，并测量相对光单位(rlu)的值。
[0071]
4、免疫分析试剂的优化及性能评估
[0072]
一系列稀释的ap-mabs(1：50，1：100，1：200，1：500，)和mab-mps(1：20，1：50，1：100，1：200，1:500)与tpai-c的标准阳性校准品(s3，10tu/ml)和阴性样品(s0，0tu/ml)反应。以两者的最大rlu比(rlus3/rlus0)确定最佳稀释度。以最佳组合为基础，绘制标准曲线(采用本发明tpai-c单克隆抗体检测tpai-c的标准曲线如图4所示，采用希森美康化学发光试剂检测tpai-c的标准曲线如图5所示)，确定其灵敏度及线性区间，并与希森美康化学发光试剂对比分析30例临床样品，以考察新开发的免疫测定方法的可行性。结果如表3所示，表3显示，阴性符合率：100.0％，阳性符合率：95.0％，总符合率：96.7％。
[0073]
表3临床相关性
[0074][0075]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。