三个拟南芥NAC同源基因突变体的ABA响应及下游基

作者：张馨予

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　　摘要：在获得拟南芥NAC同源基因（NAC019、NAC055和/VAC072）双突变体和三突变体纯系的基础上，进一步分析它们对ABA响应的生理差异及其ABA诱导相关下游基因的表达变化，深入探讨它们与ABA响应的关系。结果表明，在种子绿胚建成的过程中，NAC055和NAC072基因与ABA响应相关；在根生长方面，三者在ABA响应中作用不明显。经ABA处理后，突变体nac072和nac055n，cac072与野生型比较，RAB18、RD29A和RD29B基因表达上调显著，推测在ABA响应的基因表达调控过程中，MC072和NAC055起负调控协同作用，而NAC019则发挥拮抗作用。关键词：NAC；拟南芥；突变体；ABA响应中图分类号：Q786
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　　文献标识码：A
　　文章编号：1007-7847（2015）02-0114-05Study on the Response to Applying ABA and Expression Changes of ABA Induced Relative Genes in Arabidopsis Mutants of Three NAC Homologous GenesLU Jia-bao1， LI Xiao-yun1*， LIU Xu2， LI Xiao-lin1， LI Yi-hao1， LI Ling1College of Life Science，South China Normal University， Guangzhou 510631， Guangdong， China； 2. South China Botanical Garden， Chinese Academy of Science， Guangzhou 510650， Guangdong， China）Abstract ： The double and triple mutants of three Arabidopsis NAC homologous genes （NA CO 19， A^4 C055 and NA C072） have been obtained previously. To reveal the relationship between the NAC genes and ABA response， the response to ABA and downstream genes were further analyzed in NAC mutants. In the process of seed cotyledon greening， the NA C055 and NA C072 genes were found associated with ABA response. In terms of seedling root elongation， three NAC genes were seen not associated with the ABA response. Compared with the wild type， the gene expression of RABIS， RD29A and RD29B increased significantly in nac072 and nac055nac072 mutants after ABA treatment. These results suggested that NA C072 and NA C055 negative regulated synergistically in the process of expression regulation of ABA response genes， whereas NACO 19 antagonized NAC072 and NAC055.（Life Science Research， 2015，19（2）： 114?118）
　　NAC（ NAM， ATAF，CUC）转录因子是特异存在于植物中，具有多种生物功能的一类新型转录因子。NAC转录因子的N端含有高度保守的NAC结构域，用于结合DNA，调节转录活性，C端是高度变异转录激活区[1]。NAC转录因子具有诸多方面的功能，如参与植物次生生长、激素信号转导，以及在与生物胁迫和非生物逆境中发挥作用[2，3]。从拟南芥中分离到3个不同的NAC基因NAC019、NAC055和NAC072，干旱诱导其表达，能与NACRE（NAC response elements）的核心元件CACC和MYC-Like元件CATCT的DNA体外结合[4]。NAC072被报道参与ABA介导的逆境信号传导途径，超量表达显著增强转基因植株ABA敏感性，瞬时表达激活多CACC元件启动子活性[5]。NAC019在ABA信号传导中也起正向的调节作用[6]；NAC019和NAC055在JA和ABA的信号转导途径之间存在交叉对话[7]。拟南芥NAC072（RD26），NAC019和NAC055编码蛋白氨基酸序列同源性高，且其表达模式和遗传功能类似。目前这3个胁迫相关NAC亚类基因之间关系不清楚。本文构建突变株NAC019、NAC055、NAC072的双突变和三突变植株，通过不同突变植株的ABA生理响应和ABA信号途径相关基因表达变化，分析三者之间的功能关系及其参与ABA信号的可能角色。为揭示ABA介导下，NAC转录因子与ABA信号的关系，及认识ABA信号转导中转录因子可能的调节机制提供依据。1材料与方法1.1植物材料野生型拟南芥Col由实验室保存，纯种单基因突变体nac055、nac019和nac072种子购于拟南芥资源中心（Arabidopsis Biological Resource Center），由本实验室筛选与保存。1.2方法1.2.1植物培养拟南芥种子用75%的乙醇溶液（含0.5% TritonX-100）浸泡2min，用无水乙醇快速漂洗后，撒到1/2MS培养基上。4℃放置2d，然后在光照培养箱中（昼夜温度为22℃/20℃，光照周期为16h/8h，平均湿度为40%～60%）培养6d。将其移栽到由泥炭土、珍珠岩按3：1（V/V）比例拌匀的培养土中培养。培养土预先用营养液（1/4MS）浇透待用。用镊子将幼苗移栽到湿润的土上，盖上一层保鲜膜，培养2-3d幼苗，揭开保鲜膜。在植株抽苔及抽苔后1-2周，以1/4MS营养液浇透培养土。培养过程中视情况适当浇水。1.2.2拟南芥突变体杂交按照表l，分别将开花的突变体（作为父本）与未开花且雄蕊未成熟的突变体（作为母本）杂交，经两次种植分离并PCR鉴定后，获得nac019nac055、nac019nac072和nac055nac072双杂交纯合体。同理，将开花的nac072与未开花且雄蕊未成熟的拟南芥nac019nac055进行杂交。待荚果成熟后单独收种子，经3次种植分离并PCR鉴定后，获得三突变体nac019nac055nac072。1.2.3杂交株鉴定　　利用三引物PCR法筛选纯合体，RT-PCR分别对拟南芥突变体（nac055nac072、nac019nac072、nac019nac055和nac019nac055nac072）纯合子进行基因表达鉴定。所用的特异性引物组合为：N019-ORF-F和N019-ORF-R，LBal和N019-ORF-R，N055-ORF-F和N055-ORF-R，N055-ORF-F和LBal，RD26-F和RD26-R，RD26-F和LBal（表2）；PCR程序：94℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸70s（有LBal时：70s；若全长R+F：1 min 40 s），38个循环，72℃延伸10min：1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。1.2.4基因表达检测按照文献[8]方法从Col和纯合文变体植株提取总RNA。用TaKaRa RTase M-MLV反转录合成cDNA，参考TaKaRa公司RTase M-MLV反转录试剂使用说明，利用特异引物（表2），通过PCR和DNA凝胶电泳检测相应的cDNA。1.2.5种子绿胚统计种子经常规消毒后，分别点种在含有0.05、1、2μmol/L， ABA的1/2 MS固体培养基上（不含0.8%的蔗糖），放于光照培养箱中4℃春化4d。然后在22℃培养第7d，开始统计绿胚率，以绿胚长出绿色子叶为准。重复3次。1.2.6根生长统计种子消毒后播种于1/2 MS培养基，4℃放置4d后，放于光照培养箱中培养。长出两片子叶（约3d）后，移至分别含有0、15、30 μmol/L ABA的1/2 MS固体培养基上（含0.8%的蔗糖），平板垂直培养7d，测量幼苗的主根长度。用SonyF116数码相机拍摄主根的生长，计算主根增长率：主根伸长率（%）=处理的主根长/对照的主根长×100%。1.2.7数据统计数据结果通过Spss 13.0分析。2结果与分析2.1杂交双突变体和三突变体的筛选与检测通过RT-PCR方法，对拟南芥野生型Col和NAC突变体nac019、nac055、nac072、nac055nac072、nac019nac072、nac019nac055和nac019nac055nac072进行鉴定，根据突变体植株中不能表达所缺失的相应突变基因，确认三者的单基因突变体nac019、nac055、nac072以及三者的杂交突变体nac019nac055、nac055nac072、nac055nac072和nac019nac055nac072（图1）为纯合突变体，可用于进行后续的生理实验以及基因表达量的检测。2.2NAC突变体的ABA生理响应
　　野生型（对照）和用0.5 μmol/LABA浓度处理的突变株系的种子在培养7d正常萌发，经1μmol/L和2μmol/LABA处理的种子萌发7d，大部分缺乏绿胚，没有出现绿叶（图2）、经0.5μmol/LABA处理后，突变体nac055、nac055nac072、nac019nac055的种子绿胚率比野生型高16%―22%，其中nac055种子的绿胚率最高（图2），说明NAC055在种子萌发过程中对外源ABA响应较强，缺失NAC055基因突变体植株（如nac055、nac055nac072、nac019nac055）的ABA敏感性较弱。从ABA处理对根生长影响的来看，发现各突变体对ABA敏感性均没有显著性差异，推测它们在根生长对ABA响应中的作用不明显。2.3NAC突变体的ABA相关下游基因表达检测RD29A、RAB18、RD29B基因皆是ABA介导的信号途径中的重要关键基因。为了认识NAC转录因子成员参于ABA介导的信号途径情况，我们分析ABA处理后的NAC突变体体内RD29A、RAB18、RD29B的表达变化。结果表明，经ABA处理后野生型和NAC突变植株的RD29A、RAB18和RD29B表达量显著上调（图5）。但在突变体中的3个基因表达模式大致相同，即NAC三突变体nac019nac055nac072以及NAC双突变nac019nac072、nac019nac055植株中RD29A、RAB18和RD29B的诱导表达与野生型无显著差异，而单突变体nac072和双突变体nac055nac072比野生型显著上升，双突变体nr055nac072的表达变化最显著，推测NAC072和NAC055在人ABA响应下游基因调控中可能发挥负调节作用，NAC072的作用更大，而NAC019可能拮抗前两者。3讨论
　　NAC转录因子是特异性存在于植物中的一类转录因广，家族成员多，模式植物拟南芥含有110多个NAC家族成员，单子叶植物水稻中存在120多个NAC同源基因[9]。NAC转录因子在不同发育时期和多种环境因素诱导下，激活特定目的蛋白发挥着各种重要生物功能，主要涉及对植物体生长发育的调控和环境胁迫影响[1]。本文的研究结果表明，nac055、nac055nac072、nac019nac055突变体在0.5μmol/LABA处理后，萌发率高于野牛型，其中nac055萌发率最高，如nac055、nac055nac072和nac019nac055突变体ABA敏感性弱。推测NAC055在种子萌发过程中对ABA响应发挥重要作用，缺失NAC055的突变体，已知NAC055拟南芥过表达植株存在较强的抗旱性，为ABA、盐和干旱显著诱导[4]，其可能与NAC019共同作用JA途径[7]。目前关于NAC055参与ABA种子萌发具体机制并不清楚，与其他两个成员相比，可能与其特殊的组织表达模式和调控方式相关，需要进一步深入研究。但其单突变体的生理报道缺乏。ABA处理拟南芥根生长的实验结果发现，各突变休与野生型相比在ABA敏感性方面均存在显著差异，说明三者在根生长的ABA响应中不发挥主要作用。
　　RD29A、RD29B、RAB18基因是最常选择的拟南芥胁迫相关下游Maker基因，它们快速响应各种非生物胁迫和ABA的诱导作用[10、11]，反映植物在胁迫条件下基因表达的响应强度。RD29A是不依赖型ABA的相关下游基因[10]。其在无内源ABA时亦应答干旱等非生物胁迫，ABA处理可诱导该基因大量表达，能快速反应胁迫处理的强度；RD29B是经典的拟南芥ABA依赖型下游诱导基因，其启动子具有两个重要的ABA应答顺式作用原件ABRE，在无内源ABA时，不能或显著减弱对胁迫应答的诱导表达[11]，其表达差异准确反应ABA信号的强度，是研究ABA诱导基因表达的必需下游Maker基因。拟南芥RAB18是富含Gly（33%）的脱水相关蛋白，ABA处理可以诱导该基因大量表达[11]一般情况下，ABA处理后RAB18基因表达变化与RD29A和RD29B变化趋势相同，三者共同反成ABA响应的下游基因表达强度。　　对突变体ABA相关下游基因表达分析的结果发现，相比野生型和其他突变体植株，nac055nac072在ABA处理后，RD29A、RD29B和RAB18诱导表达量上升趋势最明显，而nac072次之，ABA处理下NAC072对RD29B和RAB18表达抑制贡献最大，当其与NAC055同时缺失后，下游基因的诱导上升趋势变化最大。这说明NAC072和NAC055可能在对RD29B和RAB18基因响应ABA诱导表达调节中发挥协同作用，对基因表达都起抑制作用。已知NAC072（也称为RD26）参与ABA的信号途径，NAC072和NAC055都为ABA诱导显著上调，其过表达拟南芥植株对ABA超敏感[5]。说明NAC072是一个ABA信号正调控者的角色，但在本研究中，其单双缺失突变体都表现出对ABA诱导下游基因的抑制作用，可能预示着其参与ABA信号的复杂形式。另外，NAC三突变体nac019nac055nac072以及双突变nac019nac072、nac019nac055植株中RD29A、RAB18和RD29B的诱导表达与野生型无明显差异，在多突变体影响ABA诱导下游基因表达中NAC019的作用与NAC072和NAC055相反。其可能拮抗NAC072和NAC055对ABA诱导下游基因的抑制作用。已知NAC019和NAC055转录因子在JA信号途径中相互协同[7]，而三者基因的过表达拟南芥均表现出相同的抗性增强表型[4]，说明三者在胁迫条件下可能发生基因功能冗余并协同作用，但也并不排除特定条件下同源蛋白间拮抗作用的发生，如同源基因间的竞争性蛋白互作和DNA结合等[12]。目前关于三者如何参ABA下游基因表达调控研究还处于起步阶段，很多问题悬而未决，还需大量研究证实。[1]刘旭，李玲.植物NAC转录因子的研究进展[J].生命科学研究（The research progress of NAC tracscriptipn factors in plant）， 2008， 12（4）： 297-302.[2]LI X L， YANG X， HU Y X，et d. A novel NAC transcription factor from Suaeda liaotungensis K. enhanced transgenic Arabidopsis drought， salt， and cold stress tolerance[J]. Plant Cell Repots， 2014，33（5）： 767-778.[3]LIU X， HONG L， LI X， et al. Improved drought and salt tolerance in transgenic Arabidopsis over-expressing a NAC transcriptional factor from Arcxhis hypogaea L[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry， 2011， 75（3）： 100614-100618.[4]TRAN LSP， NAKASHIMA K， SAKUMA Y， et al. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC tran-scription factors that bind to a drought-responsive cise lement in the early responsive to dehydration stress 1 promotei[J]. Plant Cell， 2004， 16（9）：2481-2498：[5]FUJITA M， FUJITA Y， MARUYAMA K， et al. A dehydration- induced NAC protein， RD26， is involved in a novel A BA-de-pendent stress-signaling pathway[J]. Plant Journal， 2004，39（6）：863-876.[6]JENSEN M K， KJAERSGAARD T， NIELSEN M M， et al. The Arabidopsis thaliana NAC transcription factor family： structure-function relationships and determinants of AtNAC019 stress signaling[J]. Biochemical Journal，2010，426（2）：183-196.[7]JIANG H， LI H， BU Q， et al. The RHA2a-interacting proteins AtNAC019 and AtNAC055 may play a dual role in regulating ABA response and jasmonate response[J]. Plant Signaling&Be-havior，2009，4（5）：464-466.[8]CHEN Y， LI L ， HU P， et， al. Relationship between drought re-sistance and AhNCED 1 expression in peanut varieties from four provinces in China[J]. Journal of Food， Agriculture&En-vironment，2014，12（2）：509-514.[9]OOKA H， SATHO K， DOI K， et al. Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza saliva and Arabidopsis thaliana[J]. DNA Research，2003，10（6）：239-247.[10]XIONG L， LEE H， ISHITANI M， et al. Regulation of osmotic stress-responsive gene expression by the LOS6/A BA 1 locus in Arabidopsis [J]. The Journal of Biological Chemistry，2002，277（10）：8588-8596.[11]HALLOUIN M， GHELIS T， BRAULT M， el al. Plasmalemma abscisic acid perception leads to 7M518 expression via phos-pholipase D activation in Arabidopsis suspension cells[J].Plant Physiology，2002，130（1）：265-272.[12]SONG S， QI T， WASTERN AC K C， et al. Jasmonate signaling and crosstalk with gibberellin and ethylene[J]. Current Opinion in Plant Biology.2014，24（7）：112-119.