胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定

作者：张馨予

肌生成是胎儿期和出生后早期骨骼肌生长的主要形式。肌生成的过程包括：骨骼肌卫星细胞激活后增殖、活化变为成肌细胞；随后成肌细胞分化为肌细胞；肌细胞逐渐平行排列并相互融合形成肌管；肌管进一步分化最终形成成熟肌纤维。骨骼肌卫星细胞是位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌肉干细胞，在骨骼肌的生长发育过程中起重要作用[1]。程序化观点认为生命早期各种损害、刺激性或营养状态的改变会导致器官在发育、生理功能和代谢方面发生改变，这种改变一旦被程序化，将发生永久性的改变。这一时期通常是细胞的快速分裂期，也是出生前或生命早期多数组织和系统形成的关键时期，孕母营养不良、营养过剩、感染、心理创伤、吸烟、内分泌疾病等影响可造成组织或系统发育发生不可逆的改变[2]。宫内环境可影响胎儿骨骼肌的发育，有可能导致骨骼肌出现如胰岛素敏感性等不可逆的代谢改变等[3]。早产儿在宫外生活早期，相当处于胎儿宫内生长发育的妊娠期，如营养不足或失衡及处于子宫内外环境改变的应激状态，可产生类似程序化代谢改变[4]。因此，胎鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养、纯化与鉴定，可进一步行体外胎鼠骨骼肌发育和干预研究。骨骼肌卫星细胞的体外培养是研究肌生成的技术关键。本研究旨在建立一种可靠稳定的原代胎鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养方法，为胎儿和早产儿骨骼肌发育程序化的研究提供实验基础。

材料与方法

一、材料

1.实验动物：本实验经中山大学附属第一医院医学伦理委员会批准。中山大学附属第一医院动物实验中心提供SPF级Sprague-Dawley成年期大鼠，动物实验中心饲养室温度为20℃～25℃，湿度为40%～70%，昼夜周期各12 h。按雌雄大鼠1：1合笼过夜，次日晨取雌鼠阴道分泌物涂片，镜检见精子者当日记为妊娠第1天，将孕鼠分笼并于孕18 d时剖宫取出胎鼠。

2.主要试剂：DMEM/F12培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco公司)，马血清(horse serum，HS)(北京索莱宝科技有限公司)，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)(Bio Basic公司)，Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，免疫组化染色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)，DAB染色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)，结蛋白(Desmin)多克隆抗体(Thermo Scientific公司)，青-链霉素双抗(碧云天生物技术研究所)，D-Hank’s 液(碧云天生物技术研究所)。

生长培养基(DMEM/F12+20%FBS+10%HS+5ng/ml bFGF+1%青-链霉素双抗)、分化培养基(DMEM/F12+2%HS+1%青-链霉素双抗)。

二、方法

1.胎鼠骨骼肌卫星细胞培养及纯化：采用Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶两步消化法和差速贴壁法分离纯化胎鼠骨骼肌卫星细胞。孕 18 d时，在无菌条件下剖宫取出胎鼠，置无菌培养皿。手术显微镜下取胎鼠四肢肌肉，尽量去除脂肪、肌腱等结缔组织，4℃预冷的含抗生素Hank’s缓冲液冲洗3次。将肌肉组织剪成1 mm3左右的碎块，Hank’s缓冲液洗3次。向剪碎的肌肉中加入4倍体积0.1%Ⅰ型胶原酶消化，37℃水浴30 min，每隔10 min震荡1次，180 g离心10 min，弃上清；在沉淀中加入4倍体积0.25%胰蛋白酶，吹打混匀，37℃水浴15 min，期间每3～5 min震荡1次，然后加入等体积含20%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，反复吹打，依次滤过100、200、400目的细胞筛网，180 g离心10 min，弃上清，生长培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数细胞活力(≥90%方可继续实验)。将细胞悬液接种于培养皿中，37℃、5% CO2培养箱培养，2 h后倒置显微镜下观察可见部分细胞已贴壁(P1)，将上层细胞悬液转移至新的培养皿(P2)中培养，3 d后换液，待P2中的细胞长至50%～60%密度时进行消化传代，接种前进行第2次差速贴壁(1 h)，得到的细胞即为纯化后的骨骼肌卫星细胞。

2.细胞生长曲线绘制：取分离纯化的骨骼肌卫星细胞，用0.25%的胰蛋白酶进行消化传代，以104/ml密度接种于96孔板，设3个重复孔，置37℃，5% CO2培养箱中培养，24 h细胞贴壁后每孔加入 10 μl CCK-8溶液，继续于37℃，5% CO2培养箱中孵育1 h，使用酶标仪测量450 nm光密度(optical density，OD)值。每24 h进行加药、测OD值，连续7 d。以OD值的平均值为纵坐标、细胞培养天数为横坐标描绘生长曲线。

3.肌管诱导分化：待生长状态良好的骨骼肌卫星细胞长到约80%密度后，开始肌管诱导，即换用分化培养基继续培养3 d，倒置相差显微镜下观察肌管形成情况。