构建物理图谱的重要工具

作者：张馨予

将基因组DNA片段克隆进各种载体组建重叠克隆群是物理作图的基本策略，克隆载体在物理图谱构建过程中发挥着不可替代的作用。

凡来源于质粒、噬菌体、细菌等可插入或克隆DNA片段的DNA分子统称为载体。载体的功能是为外源DNA进入受体细胞提供运载工具。经过载体重组的外源DNA比其单独进入受体细胞的效率提高几个数量级。另外，载体可将外源DNA转移至受体细胞并在受体细胞内准确复制、大量扩增和明确表达。载体除具备上述功能外，必须具有从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞的可移动性。

上述克隆库的优点是能随机覆盖基因组很多倍，并在扩增过程中表现出不易缺失和不易重排的稳定性。

一、粘粒克隆

粘粒克隆克隆示意

1、粘粒(cosmid)又称柯斯质粒，是Collins J 和Hohn B 等于1978年为克隆真核DNA 大区段构建的带有粘性末端的cos位点质粒。即含有粘性位点的质粒重组体。cosmid来源于噬菌体和质粒DNA的整合，所能克隆的最大外源片段的DNA为45.9Kb。

粘粒的组成成分包括：质粒复制起始区(ori)；抗药标记区AmpR和Kan R(分别为抗氨苄青霉素和卡那霉素的抗药基因)；一种或多种限制酶单一切点(如Not I、Bam HI)；λDNA的cos 区小片段(约20至数百个碱基，粘性末端为12bp)。载体在装载DNA片段时，先用某种限制性内切酶将粘粒切开，使两个cos位点分别位于DNA分子两端，相距约50Kb，外源DNA克隆进单克隆位点，形成连续的线性DNA分子，该段重组体包装进入λ噬菌体头部，在培养皿上筛选AmpR或KanR的转化体(见图3-1)。
粘粒克隆一般用来构建小的重叠群以便进行DNA测序。目前，通过构建的粘粒重叠克隆系进行作图是染色体作图、YAC作图和粘粒作图三水平作图中最精细的物理图谱。所以，粘粒克隆在构建完整物理图谱中是十分重要的。

2、YAC克隆

酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC) 是目前携带最大外源DNA片段的载体克隆(100—200kb)。

（1 ）YAC克隆结构

Burke等1987年构建的YAC载体主要由以下几个部分组成(图4-2)：复制起始点ori，具有启动载体DNA在大肠杆菌内复制的功能；AmpR为抗性标记基因；CEN(centromere)为着丝粒基因，指导细胞分裂过程中染色体走向和向子细胞分配；ARS(autonomously replicating segu ence)为自由复制序列；TEL(telomere)为端粒，位于染色体每条臂的末端，参与染色体末端复制以及防止核酸外切酶切断染色体臂。由于YAC是与质粒组建在一起的，所以，又常见pYA C，即由酵母菌人工染色体构建的质粒。pYAC除了上述某些基因外，还有pBR322、四膜虫 rDNA的端粒(TEL)、CEN、ARS以及一些选择标记。pYAC呈环状时，以质粒的方式在原核细胞中增殖，酶切后呈线状为YAC，可与连接的外源DNA共同在酵母菌细胞中复制。pYAC可装载200Kb-1000Kb的外源DNA，具有很强的稳定性。

YAC克隆过程示意

（2）YAC克隆DNA片段的过程是：目的基因在限制性内切酶酶解后变成大片段DNA，克隆进酵母载体DNA，转染酵母缩主细胞，扩增后，根据标记性状筛选出重组的人工染色体(见图)。

（3）YAC的主要用途是：(1)YAC克隆重叠群是物理图谱的主要框架。它不仅可容纳大片段的外源D NA ，而且在构建基因组文库时需要较少的克隆。(2)用YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物基因组分析和DNA测序中发挥着重要作用。目前，用YAC提供大片段DNA构建染色体图谱的技术已在人类、植物、昆虫、鸟类、两栖类等动物中得到广泛应用，相比于早期的DN A片段载体，YAC是容纳大片段外源DNA的首选载体。(3)在基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都采用了YAC克隆系统。通过YAC嵌入的基因不仅片段长，而且嵌入的基因更适于体内表达，并有利于基因保持其固有的空间构象和功能的发挥。

3、BAC克隆

在人类基因组分析中，普遍采用YAC克隆库作为组建含有大片段DNA的重叠克隆群，BAC只是一种补充的方法。但这种补充在克隆效率、重叠群排序、载体克隆的稳定性和克隆嵌合体等方面要优于YAC。

（1） BAC克隆载体的结构

BAC是F因子与大肠杆菌构建的DNA单拷贝重组体。1992年，Shizuya H等提出的pBAC 10 8L克隆载体系统主要包括：oriS、repE、parB、parA调节基因，当parA和parB使大肠杆菌含有1～2个拷贝时，oriS和repE间接调节F因子复制；CMR为抗氯霉素标记基因；克隆片段包括隿osN和P1loxP切点； cosN位点提供了带有胧删迥┒嗣傅淖ㄒ磺懈钗坏悖琇oxP与cosN均可作为限制酶谱的克隆排序末端；HindⅢ和Bam HⅠ为克隆位点；富含G+C 的限制性酶切位点有XmaⅠ、SmaⅠ、NotⅠ、EagⅠ、BalⅠ和SfiⅠ；T7和Sp6为克隆切点的侧翼启动子，可作为染色体步查和插入片段测序的RNA探针。
（2）构建BAC克隆库的过程包括：
a.外源DNA(包括HindⅢ和Bam HI切点、位点两侧T7和Sp6 序列及6个限制酶稀有切点)插入pMBO131的Sal I位点；b.含有cosN位点的400bp的Sa lI插入质粒SacI；c.在cosN和克隆片段之间的SacI位点插入P1loxP,构成pBAC 108L质粒。

BAC克隆构建示意图