分子克隆虐我千百遍，我仍待她如初恋

作者：张馨予

分子克隆最强攻略

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小编为你呕心沥血整理了超多干货
以下可能是史上最全、最基础的
分子克隆知识

分子克隆是一个实验室最基础、也是最重要的实验技术，照例先介绍原理！

▋ 基本原理

分子克隆是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定 DNA 片段的方法。也就是用体外重组的方法将目的基因插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化或转导的方式，引入适合的受体细胞内，使目的基因得到复制与扩增，然后再从筛选后的受体细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入 DNA 的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增，并使宿主细胞获得新的遗传特征。

还是一脸懵逼？我们可以先了解传统的分子克隆技术，下面的流程示意图可以帮助你在脑海中形成一个初步的印象。

▋ 传统分子克隆基本流程

孔子曰：「敏而好学，不耻下问」。
老实说，上面的好多内容我都不懂……
没关系，那我们就从最基础的各种名词开始，为大家一一详解！

▋ 知识小点

PCR

分子克隆的第一步一般为 PCR，以获得大量的可供连入载体的目的基因。PCR 反应的基本成分包括：模板 DNA、引物、4 种脱氧核苷酸、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，具体步骤就在此省略。得到的 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测，有杂带的需要切胶回收目的片段。

详情可查看：实验技术入门高能小课堂-凝胶电泳篇

您可能会用到：
● 高保真的 Pfu DNA Polymerase
● 快速从凝胶中回收 PCR 产物 Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System

插入 DNA 片段

就是你想要克隆的 DNA 片段，也被称为插入片段（Insert）。它可以来自原核细胞或真核细胞，可以是基因组 DNA、另一质粒的一部分或线性 DNA 片段、实验室中人工合成的 DNA 片段，或者是从 mRNA 反转录产生的 cDNA。

无论来源类型如何，制备插入 DNA 片段时常用的第一个步骤是进行限制性内切酶酶切，产生匹配的粘性末端，以便接下来将片段插入载体中。

载体

载体（Vector）是能携带外源基因（或 DNA 片段）进入细胞复制、整合或表达的工具。载体一般是质粒，也可以是噬菌体。

可以作为克隆载体的条件：
● 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源基因进入宿主细胞；
● 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；
● 具有由单一限制酶识别的位点组成的多克隆位点 (MCS)；
● 具有用于选择克隆子的标记基因，例如抗生素耐受。如果宿主整合了质粒，它将可以在含有抗生素的培养基中存活，这样允许我们选择已经成功转化了的细胞。
● 克隆载体必须是安全的，不能含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入受体细胞外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。

您可能会用到：
● 快速纯化质粒系统 PureYield™ Plasmid Miniprep System

在此小编额外为大家介绍几个小小小小的基础知识点：

限制性酶切位点
Restriction Enzyme cutting site

DNA 上一段碱基的特定序列，DNA 限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将 DNA 序列切成两段。限制性内切酶位点外一般需要有保护碱基。

多克隆位点
Multiple Cloning Site, MCS

是包含多个（最多 20 个）限制性酶切位点的一段很短的 DNA 序列。每个限制性酶切位点通常是唯一的，即它们在一个特定的载体质粒中只出现一次。

在一些载体中，MCS 位于标记基因内，可筛选已经成功拼接进插入 DNA 片段的克隆子。例如后面会讲到的蓝白筛选。

宿主细胞