环状RNA过表达 circRNA论坛

作者：张馨予

1 环状RNA过表达的3种方案

1.1 模拟內源环化模式的通用成环框架载体

吉赛生物专利技术的通用成环框架载体，基于模拟内源性的环化模式开发，使用上游和下游两个框架促使插入的环状RNA序列成环和剪切。框架序列包括一段反向重复（Alu）序列和一段效应QKI蛋白的序列，以及一段人工修改的剪切介导序列，整体框架可使插入的环状RNA序列高效率环化，并精确地在AG-GT位点严格剪切。

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优点：

通用性强。仅使用同一个载体可对需要研究的所有环状RNA构建过表达载体，适用于大批量研究。

克隆载体构建简单。实验只需以PCR扩增目的环状RNA序列，经过酶切连接到载体上，简单快捷。

环化效率高。过表达载体转染后做qPCR检测，视不同的基因和实验操作，实际测试可过表达几十倍到十几万倍。

环化准确。以Divergent Primer检测，PCR产物测序确认，无碱基添加或缺失。

不足：

对于极个别序列特殊，二级结构稳定复杂的环状RNA，可能无法准确环化过表达。

对于非AG-GT剪切成环模式的环状RNA，可能无法准确环化过表达。

1.2 简化的天然成环框架载体

参考使用文章（Liang et al.,2014）提供的简化的天然成环框架载体pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector。该载体基于circ- ZKSCAN1和circ-HIPK3的侧翼序列，分析特征并简化Alu序列，最终使用pcDNA3.1(+)构建一个通用载体pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector，载体预留酶切位点供替换克隆环状RNA。其框架和酶切位点序列如下：

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考虑到酶切位点对准确成环的影响，避免过表达环状RNA成环后错误加入酶切位点或部分框架序列，可以使用该框架构建无缝克隆载体，在AG-GT间直接插入目的环状RNA序列，去掉酶切位点。框架序列如下，N为替换的目的环状RNA序列：

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以我们的测试结果来看，使用载体pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector的酶切位点克隆环状RNA，过表达成环后有检测到错误加入酶切位点的情况，所以推荐使用该框架做无缝克隆载体。

优点：

环化效率高。过表达载体转染后做qPCR检测，视不同的基因和实验操作，实际测试可过表达几十倍到上万倍。

使用pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector构建克隆载体，只需以PCR扩增目的环状RNA序列，经过酶切连接到载体上，简单快捷。

不足：

1）使用载体pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector的酶切位点克隆环状RNA，可能会错误环化，成环后环状RNA序列内错误加入酶切位点。

2）通用性有限。该载体框架不能介导所有插入的环状RNA序列准确环化过表达，长度短的环状RNA有较大可能无法介导环化。

3）若使用该框架构建无缝克隆载体，则需要分段合成上下游框架序列和目的环状RNA序列，成本和构建周期都会偏长。

3）对于部分序列特殊，二级结构稳定复杂的环状RNA，可能无法过表达环化。

对于非AG-GT剪切成环模式的环状RNA，可能无法过表达环化。

1.3 基因特异的侧翼序列载体

基于环状RNA的侧翼序列特征，克隆其侧翼重复序列（Alu元件）和环状RNA序列，以PCR分段扩增目的环状RNA的侧翼上下游各200-1000bp序列和环状RNA序列，构建到真核表达载体上。