一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法与流程

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

本发明涉及质粒的提取方法，尤其涉及一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法。

背景技术：

质粒是染色体外能进行自主复制的遗传单位，是可以把外源基因导入细菌进行扩增和表达的载体，是基因工程的主要工具。应用质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。研究表明，高质量的质粒是细胞转染、核酸疫苗、基因治疗等成功的基础。随着基因重组药物的研究和应用的快速发展，对重组质粒的需求量不断增加，常规的实验室制备方法已经不能很好达到要求，因此，摸索一种可靠的大规模的质粒提取方法具有重要意义。

目前常见的质粒大量提取的方法有分子克隆提供的碱裂解法、煮沸裂解法、商业化的试剂盒法。

传统的碱裂解法指用碱和SDS处理大规模细菌培养物，分离质粒DNA，是目前应用最为广泛的制备质粒DNA方法。但该过程不能对内毒素进行去除，内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的一种成分，为一种热源物质，含有内毒素的物质一旦注入动物体内可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及散播性血管内凝血等毒性作用；在分子生物学实验中，内毒素的存在会降低质粒的转染效率和细胞的表达效率。

煮沸裂解法对温度控制要求较高，使得煮沸法在实验室的制备中稳定性较低，污染不易去除，不适合大规模质粒的提取。

试剂盒方法快速但费用高，不适于大规模质粒的提取。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法，既能去除内毒素，又适合大规模质粒的提取。

本发明是这样实现的：一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法，包括以下步骤：

步骤S1，进行细菌培养，进行细胞重悬，获得含有质粒DNA的细菌培养物；

步骤S2，加入适量的NaOH-SDS溶液进行混合，离心，获得含粗分离的质粒DNA的上清液，使用滤纸过滤后将上清液移入离心管中；

步骤S3，在离心管中加入异丙醇初步沉淀质粒，离心弃去上清液；加入TE溶液溶解沉淀，加入NH4Ac溶液后，离心保留上清液；在上清液中加入无水乙醇重新沉淀，获得较为纯化的质粒DNA，加入TE溶液溶解沉淀；

步骤S4，先加入NaCl；再加入PEG6000和NaCl的混合溶液，混匀；置冰上放置20-40min，离心弃去上清液，加入无水乙醇，离心弃去上清液，保留沉淀；

步骤S5，用70%乙醇洗涤沉淀，干燥后用TE溶液溶解，获得目的质粒。

采用上述技术方案，步骤S1为质粒的培养方法。步骤S2为常规的碱裂解法。步骤S3中，高浓度NH4Ac溶液的加入使蛋白杂质很好地沉淀，通过乙醇沉淀去除了残留的异丙醇对质粒的影响。步骤S4对内毒素进行了去除，提高了所提取质粒DNA的质量。步骤S5通过70%的无水乙醇的洗涤沉淀，去除残留的盐离子对质粒DNA的影响。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S3和步骤S4之间还包括步骤F:加入RNase A以去除RNA。RNase A是指核糖核酸酶 A，用来去除 DNA 样品中的 RNA。采用此技术方案，在步骤S3和步骤S4之间加入RNase A，对RNA的去除效果优于经典碱裂解法中在TE缓冲液中加入RNase A，更好地去除了RNA的污染。

作为本发明的进一步改进，在所述步骤S1具体包括：在含有抗性LB平板上培养目的菌落，取适量的目的菌落接种于含有抗性LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜，将过夜培养菌液全部倒入离心瓶中，离心，弃上清液，用振荡器打散细胞，在振荡状况下逐步加入TE溶液；直到细胞重悬，获得含有质粒DNA的细菌培养物。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S2中，所述NaOH-SDS溶液为0.2mol/L NaOH和 1％SDS的新鲜配制的混合溶液。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S2中，在离心之前加入了pH4.8、预冷的3mol/L KAC溶液。KAC溶液的作用是中和溶液的pH。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S3中，所述TE溶液为pH 8.0的10mmol/L Tris-HCl与1mmol/L EDTA的混合溶液；所述NH4Ac溶液的浓度为10mol/L。Tris-HCl是指三羟甲基氨基甲烷溶液与盐酸的混合溶液。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S4中，具体包括先加入1/3体积的5mol/L NaCl；再加入1/5体积的30％PEG6000和1.5mol/L NaCl的混合溶液。采用此技术方案，5mol/L NaCl增加溶液离子强度，有利于沉淀，30％PEG6000和1.5mol/L NaCl的混合溶液能有效沉淀质粒DNA，而内毒素不会被沉淀，由此把内毒素与质粒DNA分离开。

作为本发明的进一步改进，所述RNase A 的终浓度为10ug/mL

作为本发明的进一步改进，所述步骤S5中，所述采用70%乙醇洗涤沉淀的次数不小于两次。采用70%的无水乙醇的多次洗涤沉淀，去除残留的盐离子对质粒DNA的影响。

作为本发明的进一步改进，离心的温度为4℃。采用此技术方案，在低温下进行离心操作，保持质粒DNA的活性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：