一种质粒粗提的简易方法与流程

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

一种质粒粗提的简易方法与流程

本发明涉及一种核酸的提取方法，尤其涉及一种质粒粗提的简易方法。

背景技术：

质粒(Plasmid)是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子，是基因工程最常见的运载体。质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的叶绿体和线粒体等胞器中，大部分的质粒为环状构型，但也存在线形质粒。质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。

核酸疫苗(nucleic acid vaccine)是指含有编码的蛋白基因序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。目前对核酸苗的研究以DNA疫苗为主。DNA疫苗又称为裸疫苗。与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗具有如下优点：免疫保护力增强；制备简单，省时省力；应用较安全；贮存、运输方便等。美国FAD已批准乙肝疫苗等10余种DNA疫苗进入临床试验，这预示核酸疫苗在21将成为人类和动物与各种疾病抗争的有利武器，也显示出核酸疫苗的巨大潜力和应用前景。

提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等。各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用不同的提取方法。而且，目前质粒提取通常会使用到NaOH、醋酸、SDS、异丙醇、苯酚、硅酸纤维膜等试剂，这些试剂不但有毒有害，而且提取量少，无法规模化生产，制约了核酸疫苗的产业化与市场化。

技术实现要素：

本发明了提供了一种步骤简单而且能规模化提取质粒，且避免使用有毒有害试剂的方法。

本发明的具体技术方案如下，一种简易的质粒粗提的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)在含有质粒的基因工程菌体中加入PBS溶液重悬；

2)向步骤1所得的混合液中加入20～100ug/ml的RNA酶和1～10mg/ml的溶菌酶；

3)将步骤2所得的混合液搅拌混匀，搅拌速度为100～5000rpm/min，搅拌的时间为10～50min；

4)反复冻融3～6次，每次冻融后，进行搅拌，搅拌速度和时间同步骤3；

5)3000～10000rpm/min离心20～60min，取上清液；

6)向上清中加入乙醇，乙醇最终浓度为60～80％；

7)混匀后在2～8℃放置10～60min；

8)8000～12000rpm/min离心15～90min，收集沉淀；

9)加入TE溶液，电泳检测质粒提取情况。

进一步地，步骤1中PBS浓度的浓度为0.1M，且菌体的质量与PBS溶液的体积之比为1：2～10。

进一步地，步骤2中RNA酶的浓度不低于30ug/ml，且溶菌酶的浓度不低于3mg/ml。

进一步地，步骤3中搅拌速度为2000～3000rpm/min，搅拌的时间不低于25min。

进一步地，步骤5中离心速度不低于5000rpm/min，时间不低于30min。

进一步地，步骤6中乙醇浓度不低于67％。

进一步地，步骤8中离心时间不低于30min。

相对于传统方法，本发明提取质粒的方法：(1)操作步骤简单易行，成本低；(2)能够规模化，提取量不受限制，适合产业化；(3)提取仅仅需要反复冻融菌体、乙醇沉淀两个主要步骤，避免了有毒有害试剂的使用；(4)能够提取菌体中80％以上的质粒。

附图说明

图1为实施例1的质粒提取后电泳图。

图2为实施例2的质粒提取后电泳图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

向10g含有质粒的基因工程菌体中加入0.1M PBS溶液50ml，同时加入RNA酶和溶菌酶，其中RNA酶和溶菌酶浓度分别为30ug/ml和3mg/ml；2000rpm/min搅拌30min，使溶液混合均匀；反复冻融3次。每次冻融后，2000rpm/min搅拌30min。5000rpm/min离心，30min，取上清液。向上清液中加入乙醇溶液，其乙醇最终浓度为70％。混匀后，在2～8℃放置10min。8000rpm/min，离心30min，向沉淀中加入20mlTE溶液。

使用Takara商业质粒提取试剂盒提取上述实验过程中取上清液后的菌体沉淀1g，回收的质粒加入2ml的TE溶液。

将采用本发明方法提取的质粒与使用Takara商业质粒提取试剂盒提取的质粒各取20ul进行电泳检测，同时测定质粒含量。结果显示，采用本发明方法提取的质粒浓度为8mg/ml，采用Takara商业质粒试剂盒提取上述实验过程中取上清液后的菌体沉淀的质粒浓度为1.2mg/ml。该结果与电泳结果(见图1)一致。图1中上清指采用本发明方法提取的质粒；沉淀指采用本发明方法提取之后的菌体采用商业Takara质粒提取试剂盒所提取的质粒；M指DNA Marker，分子量为2000。通过计算可知，本发明的简易方法提取了大部分菌体中的质粒(8/(8+1.2)＝86.9％)。

实施例2