基于液滴微流控的细胞凝胶微球研究进展

作者：杨超月

　　微流控(microfluidics)是指可以在微纳米尺度上处理或操纵微小流体(体积为10–9–10–18 L)的技术。具有微型化、集成化特征。微流控装置被称为微流控芯片。微流控的重要特征之一是在微尺度环境下具有独特的流体性质，如层流和液滴等，据此可实现常规方法难以完成的微加工和微操作，使之在诸多学科领域存在巨大的发展潜力和广泛的应用前景。微流控在生物医学领域的主要应用方向有：(1) 临床诊断，具有快、便、小、少、多、简、短等优势；(2) 体外仿生模型，利用仿生微结构和水凝胶等生物材料制备的微流控芯片适合在体外实现组织：液滴微流控技术在微纳米尺度上对多种流体的流动进行精确控制，从而能够以高通量的方式生成结构可调和成分可控的微纳米液滴。通过结合合适的水凝胶材料和制造方法，可以将单个或多个细胞高效地封装进水凝胶中，制备细胞凝胶微球。细胞凝胶微球可以为细胞的增殖、分化等提供一个三维的、相对独立可控的微环境，在三维细胞培养、组织工程与再生医学、干细胞研究和单细胞研究等生命科学领域具有重要价值。

　　凝胶微球作为一种先进的功能材料，在多个领域均具有重要的应用价值，尤其是作为细胞载体，它可以很好地模拟细胞在体内的生存环境，为细胞提供一种新颖的三维培养方式。而基于液滴微流控技术生成的微球因其尺寸、结构和组成便于调控，已成为制备细胞凝胶微球最有效的技术之一。本文综述了利用液滴微流控技术制备细胞凝胶微球的基本原理和方法，重点介绍了细胞凝胶微球在生物医学领域的应用。

　　1 液滴微流控

　　微流控技术是一种可以在微纳米尺度上处理和操控少量液体(10–9−10–18 L)系统的技术[1]，基于微流控技术的装置称为微流控芯片，具有微型化、集成化等特点。液滴微流控是指通过微通道内互不相容的多相流体生成离散的液滴，并对其进行操控[2]。基于微流控技术生成的液滴具有单分散性好、无交叉污染、可重复性高等优点，广泛应用于生物、化学、物理等多个学科领域，成为微流控领域的一个重要分支。

　　生成液滴的方法和技术有很多种，根据液滴生成过程中是否施加外部能量，可以分为被动法和主动法。被动法生成液滴，是指利用不同的微通道结构使不混溶的分散相和连续相流体在通道连接处相遇，通过调节通道结构、两相流速大小及流速比，可以在通道连接处下游生成大小可控的液滴[3]。根据通道几何形状的不同，被动法生成液滴(表1)又可以分为T型通道法(T-junction)[4]、流聚焦法(flow-focusing)[5]和共轴流法(co-flow)[6]。主动法生成液滴是指在液滴生成过程中，通过局部施加电场力[7]、磁场力[8]和离心力[9]等外力控制液滴的生成(表2)。

　　表1 被动法生成液滴的特点和微通道结构简图

　　表2 主动法生成液滴的原理和特点

　　近年来，液滴微流控技术的发展主要体现在以下几个方面：在芯片制造方面，由于新材料的不断引入和技术的进步，微流控芯片经历了由硅[10]、玻璃[11]、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)[12]到纸基材料[13]的变化；在液滴生成动力学方面，深入研究了液滴的生成原理，即液滴通常是在被动的流体压力或主动的外部驱动下生成的，了解其独特的流体动力学可以对液滴及液滴界面进行精确控制，也使得设计新颖的液滴微流控系统来生成和操纵具有不同结构和功能的液滴成为可能[14]；在应用方面，随着理论和技术的进步，液滴微流控在微反应器[15-16]、组织工程与再生医学[17]、药物输送[18]、人工细胞[19]、肿瘤免疫疗法[20]和单细胞研究[21]等诸多领域均占据了重要的一席。

　　2 细胞凝胶微球的制备

　　液滴微流控技术能够以高通量的方式制备大小、成分和功能可控的单分散液滴，这些液滴可以封装一种或多种细胞，作为模板来制备具有特定理化性质且能够抗剪切应力的细胞凝胶微球。用来进行封装细胞的水凝胶材料种类繁多，主要可以分为两大类：一类是天然高分子，包括海藻酸盐、壳聚糖、琼脂糖、明胶、纤维蛋白原和多肽等；另一类是合成聚合物，包括聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)、聚丙烯酸(polyacrylic acid, PAA)和聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)等[22-23]。天然高分子具有良好的生物相容性和可降解性，合成聚合物在机械性能和生化信号的可控性方面具有优势，因此，实际应用中通常采用混合水凝胶，结合二者的优势，能够为细胞提供可控的微环境和必要的锚定位点，并调控细胞的生命活动。

　　在典型的细胞封装过程中，含有细胞的水凝胶前体溶液经过连续相的剪切，形成一个个单分散液滴，通过触发交联，形成细胞凝胶微球。微球的尺寸、形状、孔隙率和机械性能可以通过改变微通道尺寸、两相流速、水凝胶材料、水凝胶浓度以及交联密度等因素来调节。根据封装细胞的水凝胶材料的不同，制备细胞凝胶微球的交联方式各异，主要包括光交联、离子交联和温度诱导交联等(图1)。

　　2.1 光交联

　　光交联通常是在可聚合材料中加入光引发剂，待生成前体液滴后再将其置于可见光或紫外光的照射下引发聚合[24]。这一过程发生速度快，可在数秒内诱导交联，液滴稳定性好，对细胞的损伤较小，是目前应用最广泛的交联方法之一。光交联的关键除了光引发剂的选择和严格控制光引发剂的浓度与光照时间外，选择合适的可聚合材料也很重要[25]。目前，可用于构建光交联的生物相容性水凝胶材料主要包括透明质酸、明胶和壳聚糖等天然大分子[26-28]以及聚乙二醇、聚丙烯酰胺和聚丙烯酸酯等合成大分子[29-30]。Finklea等[17]将人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)包裹在聚乙二醇修饰的纤维蛋白原前体液滴中，液滴在可见光下照射1.6 s即可完成交联，形成载hiPSCs的凝胶微球。聚乙二醇修饰的纤维蛋白原水凝胶显示出优异的生物相容性和机械性能，载hiPSCs凝胶微球在诱导分化第8天即可分化为心脏组织，该工程化心脏组织呈现自主收缩功能，并保持自发收缩长达3年以上，能够对药理学和电刺激产生反应。