凝胶电泳的分类（默克干货分享凝胶电泳Norther

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

什么是NORTHERN和Southern印迹？

核酸与蛋白质等大分子向固相支撑膜的转移称为印迹。通过凝胶电泳分离的DNA和RNA分子的片段分别在称为Southern和Northern印迹的过程中转移到尼龙或硝酸纤维素膜上。Southern印迹由Edwin Southern于1975年推出，是一种检测DNA样品中特定DNA序列的方法。基于该方法出现的其他印迹技术被称为Northern印迹（用于RNA）、Western印迹（用于蛋白质）、Eastern印迹（用于翻译后蛋白质修饰）和Southwestern印迹（用于DNA-蛋白质相互作用）。更多内容到默克sigma试剂官网查看：

Southern和Northern印迹实验方案包括以下主要步骤：

DNA/RNA的纯化：从细胞或组织来源中提取和纯化DNA/RNA。

消化DNA：用限制酶把DNA消化成片段。RNA不需要该步骤。

凝胶电泳：在琼脂糖凝胶上分离DNA片段。RNA样品可以在琼脂糖凝胶上用甲醛分离，甲醛作为限制RNA分子二级结构的变性剂。

转膜：将DNA/RNA片段从凝胶转移到尼龙膜上。

预杂交（封闭）：用含有鲑鱼精子DNA的预杂交溶液清洗尼龙膜，以封闭非特异性DNA相互作用并降低背景噪音。亦可使用PerfectHyb™ Plus缓冲液，这种情况下不需要用鲑鱼精子DNA进行封闭。

探针的制备：准备新的探针DNA并用32P α标记的dCTP标记。

杂交：用标记的探针孵育印迹。

探针的检测：在-80 °C下曝光胶片，检测探针和目标DNA/RNA序列。

凝胶电泳的分类（默克干货分享凝胶电泳Northern和Southern印迹实验方案及简介）(1)

图 1.DNA/RNA印迹操作程序中的步骤

所需材料

用于DNA分离和纯化的试剂

用于限制性消化DNA的试剂

琼脂糖凝胶电泳的试剂和缓冲液

琼脂糖凝胶电泳仪

Whatman滤纸

纸巾

带正电荷的尼龙膜

鲑鱼精子DNA

杂交管

X光胶片

所需缓冲液

10X TBE（93290），用于凝胶电泳。对于较大的DNA片段，可以使用TAE缓冲液（65497）代替TBE。或者使用Bionic™缓冲液（B6185）代替TAE或TBE，以在更短的时间内获得更清晰的条带。您可以使用以下试剂制备10X TBE缓冲液：

TRIS 1.3 M
硼酸 450 mM EDTA 25 mM

20X SSPE（S2015），用作预杂交和转膜缓冲液。在类似的印迹实验方案中，可以使用20X SSC（93017）代替SSPE。或者您可以使用以下试剂制备20X SSPE溶液：

NaCl 2.98 M
EDTA 0.02 M
磷酸盐缓冲液（pH 7.4）0.2M

变性溶液（N1531），用于使dsDNA变性，以使其与探针结合。或者您可以使用以下试剂制备1X变性溶液：

NaCl 1.5 M
NaOH（S5881）0.5 N
将pH调节至~13

中和溶液（N6019），用于在变性dsDNA后中和凝胶。或者您可以使用以下试剂制备1X中和溶液：

NaCl 1.5 M
TRIS HCl 1M
将pH调节至7.5

*Denhardt溶液（D2532），在预杂交过程中用于封闭非特异性DNA杂交。或者您可以使用以下试剂制备50X Denhardt溶液：

牛血清白蛋白（A7906）1％
聚蔗糖（F2637）1% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP40）1% 将组分溶解在水中至最终体积为50 mL。过滤除菌。

*2X预杂交溶液（P1415），用于准备探针杂交所用的膜。或者您可以使用以下试剂制备1X预杂交溶液（100 mL）：

20X SSPE 30 mL
100X Denhardt溶液10 mL 10％ SDS 10mL 水50 mL

*杂交溶液（H7140），用于杂交步骤。或者您可以使用以下试剂制备杂交溶液（100 mL）：

20X SSPE 30 mL
10% SDS 10 mL
水60 mL

1X探针缓冲液，用于探针混合物。（100μL；新鲜制备）：

1 M TRIS，pH 7.6 50μL
2 M MgCl2 5μL 0.5 M DTT 10 μL 水35 μL

1X探针混合物（27 μL）：

探针缓冲液 2.7 μL
寡核苷酸探针（0.2 μg/μL）2μL T4磷酸核苷酸激酶（PNK）1 μL 水11.3 μL 32P-ATP 10 µL

6X低苛性洗涤溶液，用于去除低同源性杂交并降低背景噪音。使用以下试剂制备600 mL洗涤溶液：

20X SSPE 180 mL
10% SDS 12 mL
水408 mL

1X高苛性洗涤溶液，用于去除紧密同源杂交，并进一步降低背景噪音。使用以下试剂制备600 mL洗涤溶液：

20X SSPE 30 mL
10% SDS 12 mL
水558 mL

*PerfectHyb™ Plus杂交缓冲液（H7033）可用来代替Denhardt、预杂交和杂交溶液。PerfectHyb™ 缓冲液经过优化，可在短至1-2小时的杂交中产生最大信号，且背景最小。PerfectHyb™ Plus配方适用于使用任何类型的探针、以及在任何类型的膜（带正电或中性尼龙和硝酸纤维素）上进行的任何杂交实验方案。

DNA分离