Nat Neurosci：AD模型中错误的自噬溶酶体酸化诱导神

作者：张馨予

　　导读

　　自噬是溶酶体降解的主要途径，通过构成性转化废弃的蛋白质和细胞器来维持细胞的内稳态。阿尔茨海默病（AD）中的自噬功能明显受损。近日，Ju-Hyun Lee 等人在《Nature Neuroscience》期刊上发表了题为“Faulty autolysosome acidification in Alzheimer's disease mouse models induces autophagic build-up of Aβ in neurons, yielding senile plaques”的文章，揭示了五种AD模型小鼠体内神经元独特的自噬失调，并使用神经元特异性的自噬和pH的转基因mRFP-eGFP-LC3探针、多重共聚焦成像和相关的光学电子显微镜来确定其基础。早在细胞外淀粉样蛋白沉积之前，神经元中的自噬溶酶体酸化程度就下降了，这与vATP酶活性显著降低和扩大的去酸化自噬溶酶体中Aβ/APP-βCTF的选择性积累有关。在更多受损但仍完整的神经元中，大量Aβ阳性的自噬空泡（AVs）堆积成大的膜泡，形成花状的核周花环。这种独特的模式被称为PANTHOS，也存在于AD的大脑中。更多的AVs合并成膜小管的核周网络，其中纤维状β-淀粉样蛋白在管腔内聚集。溶酶体膜通透性增强，组织蛋白酶释放，溶酶体细胞死亡，并伴有小胶质细胞的侵袭。定量分析证实，在淀粉样前体蛋白AD模型中，表现为PANTHOS的单个神经元是老年斑的主要来源。

　　检测体内ALP功能障碍

　　THY-1启动子驱动的串联mRFP-eGFP-LC3转基因（tfLC3）在出生后在神经元中特异性表达。tfLC3的表达水平比内源性LC3水平大约高一倍，并且对自噬-溶酶体途径（ALP）没有可检测到的影响。像内源性LC3那样，tfLC3与自噬体（AP）膜结合，并在AP-LY融合后作为内在化底物在AL内降解，最终产生非荧光溶酶体（LYs）。AP上的tfLC3在AP的中性pH下发出黄绿色荧光（eGFP/mRFP），但是与LY融合后的自溶体（AL）成熟使AL酸化，导致荧光从黄色转变为橙色，然后转变为红色，因为eGFP荧光在pH 6.0以下被淬灭。用第三个荧光团标记的LY标记物（如组织蛋白酶D（CTSD）或LAMP 2）进行免疫组织化学荧光（IHF）标记，可以显示在荧光LC3自噬清除后或在新的LY生物发生之后的LYs。值得注意的是，这第三个荧光团也将发黄色荧光的AP与融合了LY的AP区分开来，该AP是组织蛋白酶阳性的，但是不能充分酸化，因此通过单独的tfLC3标记发黄色荧光（图1a）。后者被分类为酸化不良的AL（pa-AL）。

　　在TRGL小鼠的原代神经元培养中，当从AP到AL的转变在逆行轴突运输过程中延长时，AP成熟和酸化最容易被意识到（图1b）。在完整的成熟大脑中，AV的数量要少得多。完全酸化的AL集中在神经元的核膜和近端树突内（图1c，箭头）。在新皮质核周体的三荧光团（RGB）分析中，ALs发出紫色荧光（红色和蓝色的组合），反映了有效的核周体酸化机制（图1d，顶部）。为了在体内模拟AL/LY酸化缺陷并验证tfLC3探针在体内完整的大脑中的有效性，6月龄的TRGL小鼠通过脑室输注了两亲性弱碱氯喹（CQ）或单独的载体（对照）5天，并对新皮质层III-V中的神经元进行成像（图1d）。当囊泡pH高于6.0时，tfLC3阳性的斑点发出黄色荧光。仅基于绿色/红色通道合并，这些点将被错误识别为AP；然而，具有CTSD抗体和Alexa Fluor 647二抗的IHF将这些斑点鉴定为CTSD阳性，因此鉴定为pa-AL。在三通道合并中，它们发出白色荧光（绿色、红色和蓝色荧光）（图1d，RGB合并底部），与正常神经元中的紫色酸化的AL形成对比（图1d，RGB合并顶部）。LYs在CQ后保持蓝色，反映了它们对被IHF检测到的pH不敏感（图1d）。计算机算法根据三种荧光团的色调角度和饱和度来确定每个囊泡的相对贡献，这是比视觉感知更精确的“颜色”（和囊泡特性）的客观表示。

图1.TRGL小鼠脑内双标记自噬传感器的设计和表达

　　AL酸化不足出现在β-淀粉样蛋白沉积之前

　　我们将TRGL小鼠与Tg2576小鼠杂交，后代是一种在10~12个月大时开始出现β淀粉样斑块的AD模型。1.6个月大的Tg2576/TRGL杂交后代中的ALP模式与单TRGL同窝出生的小鼠无法区分；然而，到5个月大时，除了酸化ALs之外，超过90%的新皮质III-V层周质已经获得黄色荧光AVs。CTSD联合标记显示了黄色AVs仅是CTSD阳性的，因此是pa-ALs（图2a，下图）。pa-AL对于CTSB和溶酶体膜蛋白LAMP1也是阳性的。在新皮质中基于色调角的AV亚型分配和量化显示，Tg2576/TRGL的pa-ALs（每个神经元横截面9.0±0.5）比TRGL（2.1±0.3）多4倍，成熟ALs明显较少（每个神经元横截面4.4±0.4对6.6±0.3）（图2b），pa-ALs和ALs的大小增加（1.3±0.04对0.48±0.03和1.75±0.09对0.74±0）。到12个月时，Tg2576/TRGL中的核周蛋白进一步增加（每个神经元横截面17.2±0.7）（图2e，f）。为了进一步证明Tg2576大脑中的AL酸化缺陷，我们通过OptiPrep密度离心分离了AL/LY的组分,并测定了它们的ATP酶活性。与观察到的pH缺陷一致，6月龄的Tg2576小鼠的比年龄匹配的同窝出生的野生型（WT）小鼠相比降低（65.6±4.1%）（图2d），并且在Tg2576小鼠12个月大时脑中LY/AL中的vATP酶活性进一步降低（相对于WT为45.3±3.7%）（图2g）。另外两种AD小鼠模型（5xFAD和APP51）的脑中的ATP酶活性类似地降低。时间进程图表明pa-AL的年龄依赖性增加，而vATP酶活性下降（图2h）。