一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法及其在蛋

作者：张馨予

本发明属蛋白质工程领域，涉及异肽键的形成，尤其是一种涉及SpyTag-SpyCatcher系统介导的分子自催化形成异肽键，特别是一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法及其在蛋白质工程中应用。

背景技术：

一般地，蛋白质工程着力解决如下两个问题：

1、蛋白质热力学稳定性问题。

2、蛋白质功能动力学高效问题。

目前，蛋白质工程技术存在以下两方面存在着改善空间：

1、构效关系研究限制，定点突变蛋白质改性的效率不高

核苷酸为基础的定向进化，因密码子简并性造成无意义的分子多样性，增加筛选过程难度；因个别氨基酸的变化对整体蛋白质结构与功能影响有限，更不可预知的是，在肽链氨基酸序列限定后，其有意义的生物多样性饱和的事实便已经决定了的能否通过这样的进化获得期望的工程蛋白质；

2、多肽或蛋白质的定点化学修饰，存在生产成本高及产品质量均一性不好控制等问题。

本发明公开一种新的蛋白质工程方法，在一定程度上可以突破上述生物多样性饱和特性的限制，而且因降低了负突变数量，其进化速度有了显著的提高，而且其产物均可通过基因预编程实现，没有后续的化学修饰。在玉米黄质裂解酶改性中显示出了本发明易于实施、进化速度快、效果明显等优点。

随着生物学发展，越来越多蛋白质生理生化功能得到阐明，并进入酶制剂或医药蛋白开发成为生物产业的重要分支领域，其地位逐渐受到重视，尤其世界杯2022预选赛积分榜、生物能源、生物资源转化等领域展现出了令人鼓舞的前景。目前，工业酶制剂主要集中在底物为糖类、蛋白质、果胶、脂肪酸等少数品种，与已发现的酶类相比几乎处于起步阶段，这一方面反映了市场的需求状况，更深层次的原因在于其自身催化特性与工艺需求的差距。为增加酶催化的工艺适用性，通常是对酶制剂参与工艺过程之前进行预处理刺激或进行包埋等处理，如对脂酶的有机试剂预处理及包埋，延长了使用寿命，提高了其生物柴油生产中的催化效率，但这些使用前的操作无疑既费时又增加生产成本。新酶的分离、筛选成为一个新的选择，但即使不断有新的耐受性较好的酶被发现，其催化动力学方面也并不总是很理想，导致其催化效率难以维持在较高的水平。实验室定向进化技术的出现，使酶工程发展进入新阶段。一般的做法伴随着酶蛋白编码核酸序列中核苷酸的随机突变，之后，进入期望克隆筛选程序。这一过程模拟自然进化进程，理论上可以获得可能的催化特性。但这一过程也存在着显而易见的限制：首先，需要保证产生足够的生物多样性，这要求蛋白质(核酸)分子具有足够的长度；其次，因绝大多数为负突变，筛选工作依赖于高通量工作流程的建立；最后，因密码子的简并性及单个氨基酸突变在酶蛋白中影响力普遍较小等因素，导致核苷酸随机突变获得良好的酶蛋白的几率进一步降低。

目前已经发现几种异肽键形成途径，分别是：泛素化途径(ubiquitylation),类泛素化(SUMO)，转谷氨酰胺化途径(transglutamination),分选酶途径(sortase mediated reaction)及肽链链接酶途径(SpyLigase system)。其中，肽链链接酶途径最为灵活，所涉及的标签不受限于在肽链内的位置，已经应用于蛋白质工程，但仅限于定点修饰。尤其是将SpyTag与SpyCatcher分别置于多肽链的两端(C端及N端)，获得了高耐热性的改性蛋白质。因而与本发明所述不同。

肽扫描(peptide scanning)称谓源于早期的肽链内氨基酸全饱和替换技术，即，从肽链的氨基端到羧基端单个氨基酸替换，如丙氨酸扫描(Alanine scanning)。之后，逐渐发展出更多这种类似技术，直至发展到肽链内部两个氨基酸间进行的酰胺扫描，肽扫描常用于基础研究，用来探索组成肽链的各氨基酸作用。本发明就是综合分析了SpyTag-SpyCatcher系统及认识肽扫描本质的基础上，经过理性思维及实验验证获得的一种新的蛋白质工程方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有策略的不足之处，提供一种蛋白质快速进化的方法，该方法对传统蛋白质工程起到了一个手段补充的作用，同时，因可以较大的改变蛋白质结构，进而深刻影响构效关系，更容易获得传统方法不易获得的某种性状的蛋白质或多肽。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于异肽键扫描的蛋白质工程方法，其特征在于：所述方法依赖于某宿主内，分子内异肽键的形成，且这种异肽键的形成具有位置的任意，可应用于蛋白质工程领域，为蛋白质快速进化改性提供新的策略。

而且，具体步骤如下：